利用CRISPR/Cas9来攻克乙肝

在一项新研究中，麻省理工学院的研究人员利用CRISPR/Cas9 系统，对受到感染的哺乳动物肝细胞进行基因组编辑，从中删除了乙肝病毒（HBV）DNA。根据发表在《Scientific Reports》杂志上的研究结果，该研究小组靶向切割了HBV病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）的一些特异位点。

根据世界卫生组织（WHO）报道，全球有20多亿人曾受到过乙型肝炎病毒感染，大约3.5亿至4亿人罹患慢性HBV感染，在亚洲和非洲发病率尤其高。他们面临着形成肝硬化或甚至肝癌的高风险。尽管现有的抗病毒药物可以控制乙型肝炎病毒，但却不能完全清除它。因此，一旦停止治疗患者肝脏中的HBV会重新活化。这是因为cccDNA “匿藏”在细胞核中。

HBV的基因组（rcDNA）进入到细胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主细胞因子的帮助下修复成cccDNA。前基因组RNA（pgRNA）出核后，在胞质中形成εpgRNA，并与病毒的聚合酶P蛋白共价结合，诱发核衣壳化。与多数其他的病毒DNA的机制不同，HBV cccDNA通过pgRNA的反转录进行复制，而cccDNA主要以微小染色体的形式存在于肝细胞内，且其半衰期很长（33～100天），细胞核内的最长寿命可达14年。

只要还存在于肝细胞中，cccDNA乙肝病毒的复制就不会停止，并与病毒蛋白装配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝细胞，而这是导致乙肝复发的根本原因。因此，尽管每个肝细胞内只有约5～50个cccDNA拷贝，但是只要这些cccDNA池稳定，就可以使得病毒的持续感染延续，因而清除肝细胞内的cccDNA是乙肝彻底治愈所必需的。

CRISPR （clustered regularly interspersed short palindromic repeats）/Cas是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统，它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。其中的一个关键因子就是Cas酶，能用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一个就是称为导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能通过互补结合靶标。随着以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术靶标特异性不断得到提高，其在血液病、肿瘤、传染病和其他遗传疾病等一系列与人类健康和疾病相关的基因治疗的应用领域展现出极大的应用前景。

论文的主要作者之一Vyas Ramanan说：“我们为未来利用CRISPR/Cas9来靶向慢性HBV感染提供了强有力的理论依据。”

Ramanan和同事们设计了24条单链向导RNAs （sgRNAs）来靶向从在线病毒序列信息资源库中鉴别出的一些HBV基因组位点。经过初筛测试后，研究小组将三个最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒载体中，然后将它们转导到了整合HBV的人类肝细胞内。

Ramanan说：“对包含整合基因组病毒DNA的稳定转染细胞系展开实验，我们看到HBV总DNA和cccDNA逐渐减少，在36天时cccDNA下降了92%。”研究小组还观察到病毒基因表达和复制均显着减少。“进一步地在从头感染模型中我们开展研究，在第9天我们看到这些病毒参数同样大幅度降低。”

现在，Ramanan计划在人类肝嵌合小鼠模型中测试这一方法，以评估和优化传递方法和给药方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到达人类功能性的治愈。

“尽管还有很多的工作要做，但我认为这是一个有趣的开始，”Ramanan说。

原文摘要：

CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus。

Chronic hepatitis B virus （HBV） infection is prevalent, deadly, and seldom cured due to the persistence of viral episomal DNA （cccDNA） in infected cells. Newly developed genome engineering tools may offer the ability to directly cleave viral DNA, thereby promoting viral clearance. Here, we show that the CRISPR/Cas9 system can specifically target and cleave conserved regions in the HBV genome, resulting in robust suppression of viral gene expression and replication. Upon sustained expression of Cas9 and appropriately chosen guide RNAs, we demonstrate cleavage of cccDNA by Cas9 and a dramatic reduction in both cccDNA and other parameters of viral gene expression and replication. Thus, we show that directly targeting viral episomal DNA is a novel therapeutic approach to control the virus and possibly cure patients。

来源：冷泉港实验室