继全球首次人体临床实验后，川大华西CRISPR研究再获新进展

近日，来自四川大学华西生物治疗国家重点实验室的魏于全院士课题组首次采用人工病毒进行CRISPR-Cas9基因编辑系统输送，成功在小鼠肿瘤模型中完成了靶基因编辑，达到了较好的肿瘤治疗效果，相关成果发表在《美国化学学会·纳米》杂志上。

《自然》杂志关于四川大学华西医院卢铀教授首次利用CRISPR技术编辑T细胞并回输至病人体内进行肿瘤治疗的报道想必大家都看到了，惊叹于卢铀教授的勇气与先见的同时，笔者发现最近华西医院还有一项CRISPR应用研究也取得了新进展，来自华西生物治疗国家重点实验室的魏于全院士课题组首次采用人工病毒进行CRISPR-Cas9输送，成功在小鼠肿瘤模型中完成了靶基因编辑，达到了较好的肿瘤治疗效果，相关成果发表在《美国化学学会·纳米》杂志上。

大家可能会说，人体实验都已经在进行了，小鼠实验似乎也不足为奇了吧？别忘了，人体实验是进行免疫细胞T细胞的体外编辑，编辑完成后再回输治疗，但是功能强大的魔剪，只用在体外编辑T细胞似乎有点大材小用，直接在体内用CRISPR敲除肿瘤基因进行肿瘤治疗也是研究人员梦寐以求的事情。虽然目前为止已经有不少研究用CRISPR进行肿瘤基因编辑，但是这些研究存在着不少问题，使用的方法临床转化也相当困难。目前研究采用的体内给药CRISPR-Cas9质粒DNA的手段主要有三种，一种是水流动力学注射，即将约为小鼠体重10%的DNA质粒注射液通过尾静脉在3-8秒内注射到小鼠体内（脑补一下打点滴时的情形），这会造成血压瞬间升高，可能造成器官损伤，在人体内几乎无法实现；另一种方式则是采用腺病毒载体进行CRISPR质粒DNA的输送，但是腺病毒具有免疫原性，有引发免疫反应的风险，最重要的是由于CRISPR质粒DNA太大，腺病毒负载能力实在太低，因此效率不高，心有余而力不足；第三种则是局部注射质粒，其缺点不言而喻，对于人体深部疾病似乎鞭长莫及啊。

基于此，魏于全院士课题组合成了一种新型的人工病毒载体用于CRISPR-Cas9质粒DNA的输送，他们合成了靶向乳腺癌中的MTH1基因（一个可以促使基因组稳定、阻止细胞死亡的基因，乳腺癌病人肿瘤组织高表达）的CRISPR-Cas9质粒DNA（Cas9-hMTH1）在小鼠体内进行了实验验证。由于质粒DNA带负电，他们选择了带正电的氟原子修饰的聚乙烯亚胺（PF33）与质粒DNA混合，通过正负电荷相互作用形成人工病毒（PF33/ Cas9-hMTH1，实际上就是一种纳米颗粒），同时为了增强人工病毒的输送効率，他们采用一种多功能高分子RGD-R8-PEG-HA对人工病毒进行修饰得到了靶向MTH1的多功能核壳结构CRISPR-Cas9输送人工病毒（RRPHC/Cas9-hMTH1），这种高分子可以使人工病毒更稳定，同时避免被免疫系统清除，RGD和HA可以同时靶向结合肿瘤部位高表达的整合素ανβ3和CD44受体，从而提高人工病毒在肿瘤部位的富集。同时，肿瘤部位高表达的透明酸质（HA）酶可以降解HA，促进Cas9-hMTH1在肿瘤中的释放，从而增强疗效。

体外细胞转染实验表明该人工病毒的转染效率明显高于商用转染试剂SuperFect、Lipofectamine 2000及Lipofectamine 3000，表明该载体可以更有效携带Cas9-hMTH1进入细胞，同时双重靶向策略可以使该人工病毒更特异性结合并进入乳腺癌细胞完成基因敲除。功能性实验表明该人工病毒可以成功敲除MTH1，导致癌细胞凋亡，显着抑制乳腺癌细胞增殖。通过小鼠尾静脉注射人工病毒（仅含5 微克 Cas9-hMTH1，而文献报道水动力学注射需要100 微克左右）后，可发现小鼠肿瘤组织有较多的人工病毒富集，免疫组化分析也显示肿瘤部位MTH1蛋白表达量显着降低，同时小鼠肿瘤生长及转移也得到了明显的抑制。最后他们对人工病毒的安全性进行了评价，血细胞计数发现注射人工病毒对血细胞数量无明显影响，基因测序显示正常组织中的突变率均低于0.4%，且都不是插入或者缺失突变，仅为单碱基替换突变。

虽然他们认为该人工病毒具有较好的安全性，可以用于肿瘤特定基因的敲除进行肿瘤治疗，但是笔者认为0.4%的突变率是不是还是有点高呢，有没有办法再优化一下继续降低脱靶率呢？据报道，他们下一步的研究计划是使用这种人工病毒输送其他CRISPR-Cas9质粒DNA及功能化的DNA结合蛋白用于拓展该人工病毒的应用范围。

原文检索

《Artificial Virus Delivers CRISPR-Cas9 System for Genome Editing of Cells in Mice》

来源：转化医学网（微信号 zhuanhuayixue）   作者：瀚海