干货学习！CRISPR应用指南：导入DNA、RNA还是蛋白质？

在基因组编辑的世界里，CRISPR/Cas9代表着王牌。它为研究人员带来了一种简单的方法，将核酸酶、转录调控因子或荧光蛋白送到基因组中的任何地址。这种方法已改变了疾病研究、基因调控、药物开发等。

不过，研究人员首先需要将Cas9蛋白和向导RNA（gRNA）导入他们感兴趣的细胞。事实证明，他们有几种选择。

各花入各眼

在CRISPR/Cas9系统中，研究人员可以自由地选择转染DNA表达载体、mRNA和gRNA，或蛋白质。据赛默飞世尔转染部门的研发主管Xavier de Mollerat du Jeu介绍，这具体取决于研究人员需要多少蛋白，以及需要多长时间。

他解释道，DNA表达载体往往在几天内产生高水平表达的蛋白质和RNA，但有延迟，因为基因必须被转录和翻译。对于Cas9 mRNA和gRNA，编辑更快发生，因为不需要转录，但在转录本降解之后会迅速下降。蛋白当然是最快的，因为不需要转录或翻译。与RNA一样，蛋白快速周转。

Bio-Rad的全球产品经理Veronika Kortisova认为，对于Cas9而言，快速周转其实是件好事，因为与长期表达相比脱靶事件更少。“人们认为，当系统进去之后，它开展编辑并离开细胞，这样毒性较低。对于质粒，持续的蛋白表达有时会造成负面影响。”

不过，Mirus Bio的研发负责人Laura Juckem认为，这也有缺点。最明显的是，蛋白和mRNA需要实验室额外的纯化工作，成本也比质粒DNA更高。当然，研究人员也能从一些供应商处购买现成的Cas9蛋白或mRNA，比如GE Healthcare Dharmacon、MilliporeSigma、美天旎、赛默飞世尔和NEB。

转染选择多

研究人员在导入核酸时通常有两种选择：转染试剂和电穿孔。转染试剂大多为脂质体、聚合物等。一些试剂是为特定类型的目标而设计的，比如Bio-Rad的siLentFect适用于siRNA，赛默飞的LipofectamineTM MessengerMAX适用于mRNA，而Promega的FuGENE专为DNA而优化。其他的转染试剂，如赛默飞的Lipofectamine 3000和Bio-Rad的TransFectin试剂，则支持更广泛的应用。

电穿孔是在细胞膜上打了一个孔，如果分子能穿过这个缺口，则它就能进入细胞。“在导入CRISPR/Cas9工具时，Nucleofection非常高效，”Lonza的高级产品经理Andrea Toell谈道。Lonza的Nucleofection平台实现了各种细胞的电穿孔，包括难以转染的原代细胞。Toell还表示，Lonza提供了各种立即可用的操作方案，这样客户可立即启动他们的实验，而不需要优化条件。同样地，Bio-Rad的GenePulser Xcell和赛默飞的Neon系统也有类似的数据库。

最近，市场上也出现了一些CRISPR专用的导入工具。比如，赛默飞的Lipofectamine CRISPRMAXTM就是一种新配方的Lipofectamine，专用于CRISPR-Cas9复合物的导入。它配合GeneArt Platinum Cas9核酸酶一起使用，可快速发挥作用，并降低脱靶剪切的风险。

另一个选择是Clontech的Guide-itTM CRISPR/Cas9囊泡生产系统。据Hampe介绍，囊泡是由细胞系产生的一种布满糖蛋白的纳米囊泡。研究人员将他们的gRNA克隆到专门的表达载体，并将这种质粒以及表达病毒糖蛋白的质粒、Cas9和膜结合的红色荧光蛋白导入293T细胞。在系统被诱导之后，充满Cas9/gRNA的囊泡分泌到上清液中，随后可收集、浓缩并加入目标细胞中。

研究新思路

此外，还有一些场合，导入DNA、RNA和蛋白质都可行。一种是诱导多能干细胞（iPSC）的生成。目前有基于病毒和质粒的重编程试剂盒，是mRNA和自我复制的RNA系统，包括MilliporeSigma和Stemgent的产品。至于蛋白质，斯克里普斯研究所的丁盛及其同事早前将肽段与Yamanaka的4个重编程因子相融合，证明了蛋白质介导重编程的可行性。

Bio-Rad的科研人员Frank Hsiung认为，导入哪种大分子在某种程度上取决于应用。“转染的目的是让新引入的元素能调控基因表达，”他说。“这完全取决于研究人员如何操控感兴趣的基因。”

如果他们的目标是基因沉默，那么将siRNA导入细胞质可能就够了。如果快速发挥作用是关键，比如在特定时间点利用蛋白质来影响细胞行为，那么蛋白导入更有意义。

有时，这个决定不是基于实验需要，而是基于细胞本身。有些细胞难以转染，至少对质粒DNA是如此，但这并不意味着其他分子也同样。“人们普遍认为，如果细胞难以转染，那么无论转染什么都很难，”de Mollerat du Jeu解释道。其实，有些细胞只是难以忍受DNA，但mRNA和蛋白都还好。这是因为DNA需要进入细胞核，而mRNA和蛋白不用。（入核需要细胞是活跃分裂的，而mRNA和蛋白只需要进入细胞质。）

人们正在寻找转染中的圣杯，也就是毒性小、效率高并且通用的工具，Kortisova说。目前这样的技术并不存在，不过研究人员正在接近这个目标。与此同时，对CRISPR/Cas9系统感兴趣的研究人员也有了多样化的选择。

来源：生物通