上转发光技术在POCT领域中的应用

摘要：上转发光技术（up-converting phosphor technology，UPT）是以上转发光材料（up-converting phosphor，UCP）颗粒作为示踪物的一种新型的检测技术。UCP颗粒作为标记物在床边诊断（POCT）检测中，体现了无本底干扰、无焠灭、稳定性好、适于多重分析和定量分析等显著优势，具有巨大的应用潜能。本文通过介绍上转换材料发光机制和发光特点，对近年来国内外上转换发光技术在床边诊断领域的应用进行综述，为该技术领域的进一步发展进行有益的探讨。

关键词：上转发光；POCT；上转发光材料；快速检验

上转发光现象于20世纪60年代首次被发现，之后科学家对于上转发光技术的原理进行了深入的研究和探索。至90年代，上转发光颗粒首次被用作生物技术的标志物，发展至今作为新型的标记物上转发光颗粒与免疫层析技术、生物成像技术、生物传感技术等相互交叉融合，尤其是在床旁诊断领域中得到了广泛的认可和使用。

1 上转发光材料

自然界存在很多有机或者无机物质，它们收到电磁辐射后，会激发出荧光，在整个发光过程中遵循Stokes规则，即发射光的波长长于激发光的波长。20世纪70年代，科学家发现了在红外光区（波长>780nm）被激发，可以发射可见光（波长475nm-670nm）的反Stokes规则的特殊材料。据此将激发的荧光发光的分为上转（upconverting）和下转（down-converting）2种。当荧光光体吸收高能量的光能，以低能量的光子形式发射时，称为下转发光。而荧光颗粒吸收低能量的光能，以高能量的光子形式发射时，称为上转发光。

上转发光材料通常由不同稀土材料制成。

1.1 上转发光技术原理

UCP由稀土金属元素掺杂于晶体的晶格中构成，包括三种主要成分：主基质（host matrix）、吸收子（absorber）和发射子（emitter）。不同的吸收子、发射子、主基质结合可使UCP具有不同的光学性质。在主基质相同的情况下，采用相同的吸收子，不同的发射子，则它可由相同波长的红外光激发，产生不同波长的发射光，如：980nm红外光激发吸收子-Yb3+—发射子-Er3+和吸收子-Yb3+—发射子-Tm3+，分别发射550nm绿色可见光和475nm蓝色可见光；采用不同的吸收子，相同的发射子，则虽经由不同的激发光，但却可产生相同的发射光。而在主基质不同的情况下，UCP光谱特征也将改变，如：吸收子-Yb3+—发射子-Er3+，在主基质YF3、GdF3中，分别发射红色和绿色的可见光。

作为主基质的晶体材料有：氧硫化物（如Y2O2S、GdO2S、La2O2S等）、氟化物（如YF3、GdF3、LaF3等）、镓酸盐（如YGaO3、Y3Ga5O12等）以及硅酸盐（如YSi2O5、YSi3O7等）等；常用作吸收子的稀土金属离子有：镱离子（Yb3+）、铒离子（Er3+）、钐离子（Sm3+）等；常用作发射子的稀土金属离子有：铒离子（Er3+）、钬离子（Ho3+）、铥离子（Tm3+）、铽离子（Tb3+）等。吸收子和发射子这一离子对在主基质晶格内适宜的空间取向和距离，是产生上转发光的基础。上转发光的产生是一个涉及多个光子（至少两个）的光学过程。在这个过程中，上转发光材料内的吸收子（如Yb3+）至少要吸收两个低能量光子（红外光区,如970nm），而后经过一系列内部能量转换，以非辐射的形式将这两个光子的能量连续传递给发射子（如Er3+），以使其处于激发态。后者接着发生一个返回基态能级的跃迁，释放一个高能光子（可见光区，如525nm或540nm）完成能量上转。

1.2 UPT技术的发展历程

1959年，最早有研究报道利用960nm的红外光激发多晶ZnS观察到了525nm绿色发光。但由于早期最好的上转换材料发光效率不超过1%，并且由于发光二极管的发射峰与上转换材料的激发峰匹配不甚理想，因此并未达到实用化的水平。1966年Ausel在研究掺Yb和Er的无机材料和掺这两种稀土离子的BaF2荧光时又发现了上转换发光现象。1967年，Esterowitz用红外光激发CaF2：Ho3++Yb体系时发出绿色光。自20世纪80年代以来频率上转换得到了非常迅速的发展和应用，将上转换荧光粉与红外光源相配合，做成显示器件，并与发红外光的Si-GaAs发光二级管（LED）配合，能够得到绿光，其效率可以与GaP发光二极管相媲美。另外，还被用作光电实验室中检查红外激光器发光情况的红外激光检测板。用于各类半导体激光器的红外光检测、红外发光二极管发射光跟踪，YAG等大型激光器的校对等。1986年，美国Quantex公司的J.Lindmayer提出并利用了Ⅱa-Ⅵb化合物中某些杂质离子的电子被陷阱俘获和释放的现象得到红外上转换材料，发展了一种新的可擦除、可重写的光存储系统，开拓了光存储介质研究的新途径。20世纪90年代初，由于大功率LD的出现及日益成熟，同时在室温下，在氟化物晶体成功地获得了激光运转，光与光转换效率超过l%，从而使红外激光上转换材料在显示、光计算和信息处理等领域显示了广泛的实用前景。

1.3 上转发光颗粒的特点

将UCP颗粒进行表面的修饰和活化后，可以使其作为生物标记物与多种生物活性分子相结合，广泛应用于生物医学检测领域。

1.3.1 高度的灵活性

UCP发光标记物的特性以及独特的可自由组合的多样化特征光谱（吸收光谱和发射光谱），使其可同时使用于定量分析与多重分析。

1.3.2 高度敏感性

独有的上转发光现象，确保了UCP在检测的过程中绝不存在来自于外界的背景干扰。与下转发光相比，上转发光宛如半夜看星星，没有光本底的干扰，可以实现“零本底”检测；而下转发光就像中午看星星，需要去除光的干扰才能看清楚。该技术比胶体金免疫层析技术敏感10-100倍，我们研发的毒品检测拭纸比胶体金拭纸敏感10^4倍。

1.3.3 高度的稳定性

UCP的发光现象是产生于结构内部的纯粹物理过程，且以能量较低的红外光作为激发光，因而完全避免了来自检测样品腐蚀以及自身衰变导致的发光淬灭。检测拭纸条可以作为原始数据长期保存。

1.3.4 高度的安全性

惰性合成材料、红外光激发、可见光发射使得基于UCP的检测对检测者、被检者、环境均无任何危害。

2 UPT技术在POCT中的应用

随着社会的发展、科技的进步和人口整体素质的提高，要求新型的检验技术除可在大型医疗中心或实验室使用外，还能够走出医院，走进社区，面向基层。就医疗系统而言（对快速、简易性的要求），检验结果早已成为对患者进行循证诊治不可或缺的重要依据，及早获得检验结果是急性病人的快速诊断与准确治疗的前提。此外，新型的检验技术还需兼顾操作的简便性，从而在节省人力资源的同时保障检测结果的准确性。就个人而言（对便携性、简易性的要求），在日常生活中，随时了解身体状态及疾病进展情况，实现早预防、早发现、早救治，才能最大程度防止致残、致死后果，改善愈后生活质量。面对多种需求，床旁快速检测（POCT）应运而生。

POCT是指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。近年来，POCT技术因具备能缩短样本周转时间、缩短患者在诊疗场所的停留时间等优势，不仅被广泛应用于医院急诊、重症加强护理病房、呼吸科、心内科等临床科室，更由于其仪器和试剂具有便携性的优势，在重大疫情监测、食品安全、环境保护、法医、军事和灾情救援等领域显示了较大的技术优势。

2.1我国临床POCT发展现状

目前，国内的生物应急快速检测（POCT）市场，国外产品处于垄断性地位，小到血糖监测大到肿瘤标志物、心肌标记物检测，多为国外产品垄断，这其中主要包括：瑞士罗氏公司（Roche）的心血管疾病快速诊断系统（Cardiac Reader）、乳酸仪（Accutrend）、全智能型血糖检测系统（ACCU-CHECK Inform），美国博适公司（Biosite® Incorporated）的Triage诊断仪（Triage® meter plus），加拿大瑞邦生物医学有限公司（Response Biomedical Corp.）的锐普心梗/心衰诊断仪（RAMP），主要用于对肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌红蛋白（Myoglobin）、心肌肌钙蛋白I（Cardiac Troponin I）、N末端脑钠肽（NT-proBNP）等心肌梗死、心衰方面的心肌标志物进行检测。上述进口POCT产品无一例外都使用了传统的现场检测技术——免疫层析，大部分都是利用荧光素、荧光颗粒等光学材料作为标记物将传统胶体金的定性结果予以定量显示，而国内的一些POCT技术平台及其产品直接使用简单的CCD相机对胶体金结果进行灰度量化分析，由于胶体金灰度量化只能实现半定量，所以仍旧无法满足临床对定量的需要。我国自主开发诊断试剂及其配套用仪器设备，特别是全定量POCT仪器是我国诊断试剂产业的短板。

2.2 上转发光免疫分析技术的优势

UPT免疫层析技术是以UCP颗粒作为标记物进行定量免疫检测的一种方法，将稀土纳米材料、生物传感器技术和免疫层系技术完美的结合在一起。它采用了免疫层析原理进行免疫标志物的检测免疫反应后, 通过传感器定量拭纸条检测带与质控带上的UCP标记物，以检测带和指控带的定量比值来实现待检物的定量分析。依据其工作原理分为动态扫描与静态检测两种类型。动态扫描型生物传感器通过对电动平台的运动控制，实现对拭纸条两条带上UCP颗粒含量的扫描检测，扫描分辨率为20μm；静态检测型生物传感器红外激发光拭纸条表面照明区域较大，约为6mm x1.6mm，使得检测带与质控带均在其覆盖范围内。受激发区域内的UCP颗粒发出的光经光学系统成像于线阵CCD上，传感器通过对CCD输出的数据进行处理与分析。该技术可对病毒、细菌、毒品等小分子、蛋白质、核酸等生物活性分子进行检测。

2.3 上转发光免疫分析技术在临床POCT中的应用

通过上转发光结合免疫层析技术应运而生的上转发光免疫分析平台，成为我国目前唯一领先国际的，具有自主知识产权的发光全定量POCT免疫分析仪。

上转发光免疫分析仪配套试剂涵盖了心脑血管疾病标志物、肿瘤标志物、炎症标志物、早产预测标志物等多个系列的体外诊断试剂产品，重点产品包括：N末端B型钠尿肽前体定量测定试剂盒（NTProBNP，用于心衰的诊断和鉴别诊断、治疗状况分析、预后状况判断等）、降钙素原定量测定试剂盒（PCT，用于细菌感染与脓毒症的早期诊断及进程评估）、高尔基体蛋白73（GP73，用于肝癌的鉴别诊断与早期预警、术后评估）、胎儿纤维连接蛋白定量测定试剂盒（fFN，用于早产风险性预测和评估）等。上转发光免疫分析仪及试剂的操作简便，一般操作人员只需经过简单培训即可正确使用；检测对象包括血清、血浆、全血、动物脏器，甚至腐败脏器等，整个检测可在10-15分钟内完成，该技术能实现简便、现场、快速、定量、高敏感的检测，可以应用于广大的二级及二级以下医院，包括社区医院；而在大型医院可以发挥床旁诊断（即时诊断）的效果，特别是急诊等场合；该技术在国际上只有中美两国拥有，美国技术仅限于实验室研发，而我国已实现产业化。基于我国POCT市场几乎被国外进口厂家所垄断的局面，上转发光免疫分析系统性价比高，性能优异，适用性强的优势，必将产生巨大的经济效益，进一步推动企业和行业发展。

2.4 上转发光免疫分析技术在生物反恐现场检测应用

生物反恐现场检测是所有应用性检测之中要求最为苛刻、难度最大的；由于标本复杂性大，包括动物腐败脏器、掺有泥沙标本、腐臭长菌液体（酸性液体，低pH值）等，一般性胶体金快速检测无法去掉干扰影响，操作人员为士兵、检疫人员，所以操作要求简便，检测结果和数据要求准确。
UPT上转发光-生物传感器已在新疆、青海、云南、内蒙CDC对UPT系统的现场应用性能进行了系统评价。并且在众多国家大型活动当中担任生物安保工作，已推广至北京市卫生局的疾控中心系统、中国检验检疫科学研究院、消防系统、防化研究院、鼠疫防治系统等职能单位，对炭疽、鼠疫和布病等病原体进行现场快速检测，已用于2008年北京奥运会、2009年哈尔滨大冬会、60周年国庆活动、2010年上海世博会、2010年广州亚运会、2014年北京APEC会议等大型活动的安保。

2.5 上转发光免疫分析技术在食品安全检测应用

国外对于UPT在食品安全检测的研究较多。有研究将上转发光技术原理应用于血清中雌二醇素的检验，对实际样品血清中雌二醇素进行免疫检测，结果十分理想。另有研究在食品用水病原体检测的报告称UPT结合非放射性地高辛标记抗体UPT分子仪能检测1ng的病毒DNA，是未来检验生活用水、食品工业用水的发展方向之一。在国内，UPT实现了大肠杆菌O157、霍乱弧菌O1群O139群、李斯特菌、沙门氏菌等多种食品安全相关病原体的快速定量检测。此方法比胶体金技术相比具有高通量的优势，可用于快速检测食品、环境样品中的污染菌，效果极佳。

综上所述，上转发光技术的高灵敏度、高稳定性及高安全性、可同时进行多种检测等优势，在POCT领域中具有巨大的应用市场和发展潜力。

2.6 展望

UPT技术作为一项新技术，具有广泛的应用领域。上述只是讨论了该技术在医学检测领域的应用；在医学领域，该技术还可以用于体内成像、肿瘤治疗等方面。从技术本身，由于其UCP颗粒的特殊性，如何增加颗粒的发光效率，增加颗粒的水溶性仍是技术研发的关键；如何将该技术与现有技术（如磁颗粒免疫层系技术、能量共振转移技术、核酸检测技术、液相检测技术、微流控技术）等融合，发展更加快速简便技术也是该技术发展的目标；发展全自动的UPT检测系统和小型现场检测手持设备是该技术保持生命力的技术动力。因此，不断完善技术，拓展应用领域，以保持我国在该技术的领先地位。

致谢：有关UPT技术的研发受到863计划POCT课题专项（编号2011AA02A103）和北京市重大科技成果转化和产业化“600万支/年荧光纳米材料试剂盒产业化”项目资助。

文/生物应急与临床POCT北京市重点实验室，军事医学科学院微生物流行病研究所 杨瑞馥

杨瑞馥，博士，军事医学科学院微生物流行病研究所研究员，国家自然科学基金杰出青年基金获得者。主要从事细菌菌基因组学、进化与致病机制和微生物法医学基础数据库的研究，以及检验新技术的研究。近年来，在New England Journal of Medicine，Nature，Nature Genetics，PNAS，CID等杂志发表学术SCI论文200余篇，影响因子超过860，被引3800余次，H因子32；已获授权专利40余项（包括澳大利亚发明专利1项、日本发明专利1项、香港发明专利1项）；获得国家食品药品监督管理局医疗器械注册证15项。学术兼职：中国微生物学会 副理事长；中关村生物应急与临床POCT技术创新战略联盟 理事长；中国微生物学会分析微生物学专业委员会主任委员，中国医学装备协会POCT专业委员会 副主任委员；国家卫计委疾病防控专家委员会委员；国家卫生部突发事件卫生应急专家咨询委员会委员；国家卫生部食品安全委员会委员、国家和军队处置生物恐怖袭击事件专家咨询组成员；中国卫生标准委员会传染病标准专业委员会 委员等，《Infectious Diseases and Translational Medicine》主编、《PLOS Neglected Tropical Diseases》、《微生物学学报》、《人兽共患病杂志》和《中华预防医学杂志》副主编；《Journal Biodefense and Bioterrorism》、《Pathogens and Diseases》、《New Microbes and Infection》、《Journal of Genetics and Genomics》、《中华微生物学与免疫学杂志》和《军事医学》等杂志编委。近年来，获军队科技进步奖一等奖两项，北京市和中华医学会科技进步奖二等奖各一项。

来源：热景生物   作者：杨瑞馥