张爱国：如何只扩增突变的ctDNA 实现精准的分子诊断

众所周知，精准医疗需要精准诊断，分子诊断是实现精准诊断的最有利武器。同时分子诊断对病理样本的高要求以及灵敏度的高要求给精准诊断带来了挑战。那么如何实现分子诊断的精准呢？如何通过只扩增突变ctDNA来实现精准的分子诊断？DiaCarta公司总裁兼首席执行官张爱国博士在第二届中国IVD产业投资于并购CEO论坛上对此做了精彩的演讲。

精准医疗（Precision Medicine）是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式。精准医疗需要精准诊断，精准诊断的最大板块是分子诊断，分子诊断对病理样本的高要求以及灵敏度的高要求给精准诊断带来了挑战。那么如何实现分子诊断的精准呢？2015年7月16日在上海举办的第二届中国IVD产业投资于并购CEO论坛上DiaCarta公司总裁兼首席执行官张爱国博士对此做了精彩的演讲。

精准医疗需要精准诊断

精准医疗离不开精准诊断，精准诊断起源于药厂，首先要研发出精确治疗的药物，精确治疗的药物到了医生手上，医生要确定什么时间给什么病人什么治疗，这之间的桥梁就是精准诊断。精准诊断不仅对精准医疗起指导作用，对制药公司来说是不可缺少的工具，因为在临床上医生对病人的分渠和对biomarker的寻找都需要精准诊断的高技术平台。

精准诊断离不开精准的病理标本

精准诊断离不开病理标本，病理标本与技术息息相关，而标本的摄取面临很大的挑战，这些挑战促进精准诊断技术的突飞猛进。这些诊断中最大的版块是分子诊断，分子诊断对样本要求越来越高，对灵敏度的要求越来越高。对于一个病理样本来说，病人进入医院后经历多重检测后才到分子诊断，这个过程会导致病理样本的不足，给诊断带来很大的困惑。同时样本的摄取方式也存在很大的困扰，比如肺癌样本，不可能一味地摄取肺癌组织。随着技术的发展，目前可以选择无痛穿刺、癌游离DNA、微孔穿刺等技术来摄取病理样本。

精确分子诊断新纪元：循环肿瘤DNA

科学家们逐渐发现，肿瘤有着很高的异质性，标准程序（tissue biopsy）根本不足以判断癌症的预后情况。而且活检得到的是静态信息，无法准确反映癌症的演化。在这种情况下，循环肿瘤DNA（ctDNA）就成为了科学家们的新希望，它能为人们揭示更多的癌症信息，甚至跟踪癌症的发展。

癌细胞在破裂和死亡时，会释放出循环肿瘤DNA（ctDNA）等内容物，这种ctDNA是飘浮在血液中的基因组片段。对血液中的肿瘤DNA进行检测和测序，可以帮助人们通过取血得到更全面的癌症信息，告诉医生治疗是否已经起作用，肿瘤有没有演化出抗性。

ctDNA在精确分子诊断上潜力巨大，但也面临着一些问题。如不同人的ctDNA水平差异较大，而且ctDNA并不那么容易检测，特别是在肿瘤的早期阶段。另外，人们还需要在更大型的研究中进行验证，看ctDNA是否给出了足够准确的信息，且最灵敏的ctDNA检测（例如BEAMing）需要事先知道想要检测的突变，但获得这样的信息又相当麻烦。外显子组测序不需要预先知道任何信息，但检测罕见突变的需求深度测序，这样做的成本非常高。

精准诊断的大挑战：突变DNA的检测受非突变DNA的干扰

肿瘤不是特一的，肿瘤组织中除了肿瘤还包含正常的组织。而肿瘤组织中既包含突变DNA又包含非突变DNA。那么怎样排除非突变DNA的干扰？这对于精准诊断来说也是一个大的挑战。在治疗过程中突变DNA在治疗后会很快再现，这使精准诊断在时间上有一定的难度。

分子诊断创新技术：只扩增突变DNA

分子诊断无疑在精准医疗上起至关重要的作用。分子诊断技术从传统的PCR，到现在数码PCR，NGS等为精准医疗带来新的纪元。这些技术的通用特点是：从非突变DNA中寻找很小的突变DNA。然而灵敏度越高就需要更深的测序，这给灵敏度特异性带来一定的局限性，那么我们该怎么办呢？

张爱国博士说：如何提高分子诊断的灵敏度，如何从乱丛中找针（从庞大的非突变DNA中找出突变DNA），我们需转换思路。突变DNA很小，且还存在非突变DNA的干扰，这使得精准诊断更加难。如果我们可以把非突变DNA剔除，只扩增突变DNA，就可以从另一思维解决灵敏度问题。

张爱国博士在此表示他们团队研发的“‘QClamp' Xenonucleic Acid Tech”技术可解决非突变DNA干扰的困惑，该技术利用钳合探针把非突变DNA模板钳合住，使其在扩增过程不能扩增，一旦有一个突变位点钳合探针就不能杂交上，非突变模板可以正常扩增，从另一个角度来说就达到了只扩增突变DNA的目的，也可以达到灵敏度特异性的要求。这个技术得到很大同行的认可，可以在任何PCR或荧光PCR平台上应用。该技术可以在千分之一或万分之一的灵敏度上检测到突变DNA。

目前数码PCR处于研究阶段，也遇到非突变DNA的干扰。张爱国博士表示利用钳合探针可成功移植非突变DNA，可使数码PCR能以万分之一的灵敏度扩增出突变DNA。同时癌游离突变DNA由于量少，有时数码PCR也未能检测到，但通过钳合探针可检测出来。

来源：生物探索