施一公团队顶级期刊连续发文：直击生命大分子过招中的力与美

酶与底物的过招可追溯千万年，却始终无从参透。近日，施一公研究团队分别在《自然》和《科学》上发表文章，报道了人源γ-分泌酶识别两种不同底物的高分辨率结构，继报道γ-分泌酶蛋白本身的结构之后，更进一步还原生命物质间的“过招故事”。

冰封王座，一片莹蓝。

两名柔术高手的过招被定格在镜面般的冰层中。一束电子射来，击打在冰雕表面，它们弹跳开的轨迹将被高灵敏的感光元件捕获，上万倍地放大影像呈现出生命蛋白纠缠的力与美。

“酶与底物的相互作用短短一瞬，就好像剪刀剪断绳子的刹那，我们要探知的是这个瞬间的结构和机理。”文章第一作者、清华大学生命科学学院博士后杨光辉表示，人源γ-分泌酶不仅是阿尔兹海默氏症（俗称老年痴呆症）发病过程中的关键因素之一，还“执掌”着生长、发育相关的Notch信号蛋白的切割工作，稍有差错可能诱发肿瘤。

曙光出现在“半胱氨酸交联”上

冷冻电镜的发明，让人们可以直观地“看到”微小的蛋白分子，而要看到它们的相互作用，却并不容易。这就好比拍照时的静态和抓拍，前者随时可以“咔嚓”，后者却讲究个时机。

而酶与底物相互靠近到“过招”再到分离（结合—酶切—解离），是高度动态的过程，这意味着抓拍的时机极难获得。

怎么办？好的摄影师将促成最自然的“摆拍”，在这里是想尽办法获得酶与底物的复合物。

“我们尝试过很多种方法把它们‘撮合’到一起。”杨光辉说，最常用的是把它们的基因整合到一个质粒中，然后转入实验用的细胞中，使γ-分泌酶和底物同时分别表达，“我们想既然它们都在一起了，肯定会相互作用的，有可能获得结合的复合物。”

最常用的方法并没有奏效，从培养细胞中提取的蛋白并没有出现复合物的影子。既然制造机会不行，那就只能“拉郎配”了。随后团队将酶和底物的基因直接“嫁接”到同一个表达区域里，强制性地希望两者成为一个整体，仍旧没有奏效。“我们还试了很多其他的方法，但获得酶与底物的复合物结构难度非常大。”杨光辉说，“这也是为什么蛋白质复合物结构的解析经常需要数年探索。”

曙光出现在一种被称为“半胱氨酸交联”的方法上。这个复杂的名词在生活中却十分常见，例如烫头发过程中就发生了半胱氨酸交联，卷发后半胱氨酸交联在一起固定发型。它的原理是，在氧化剂存在的条件下，蛋白质中距离足够近的两个半胱氨酸形成二硫键，从而交联在一起。

在博士期间从事过半胱氨酸交联的相关实验，让杨光辉对这一方法十分熟悉，他在与导师沟通实验进展时讨论并提出了这个方法，希望能带来转机。“科研是一个厚积薄发的过程，前面学习到的很多东西，很可能有某一种是攻克其他重要课题时用得到的。”杨光辉始终记得老师施一公的指导，在大量的文献中学习积累、独立思考，才能在遇到难题时，找到正确的思路。

引入突变完成结对“摆拍”

半胱氨酸交联的难题是，在哪里进行修饰、引入突变。早老素（γ-分泌酶的核心组分）有467个氨基酸，底物有100个氨基酸，如果全部试一遍将是天文数字。“突变引入的位置不恰当，除了可能根本连接不上之外，还可能使得蛋白本身不表达，或者使得蛋白的性质、功能等发生改变。”杨光辉说，在做之前虽然很难说有几成把握，但是过往的积累和思考能够帮助探索加速。

在谜底揭开前，他们并不知道酶和底物“过招”时哪个部分离得最近。“由于2013年时，我们曾获得了γ-分泌酶的三维结构，因此对这个酶有一定的了解。”杨光辉说，团队选择了柔性最强的区域。因为酶在进行作用时肯定要发生构象变化，柔性意味着这里是可能的变化区域。

杨光辉还对该区域进行了精细到序列位点的分析，一定程度上预估了酶与底物作用时可能发生什么。通过综合考虑多种信息，最终，团队在酶和底物上分别先挑选了4个位点，以16种组合进行试验，对基因上的点稍作修饰，让部分区域的氨基酸分子表达为半胱氨酸，在氧化环境下，二硫键的吸引力让二者的结合成为可能，复合物也就“摆拍”成型了。就这样通过让蛋白质与底物换各种“摆拍”方式，蛋白质电泳在大小正确的位置上终于有了像模像样的条带。“那是2017年的冬天，我们终于获得了复合物。”杨光辉说，难以置信和兴奋异常结伴而来，让他连着几天也没能睡好，毕竟，γ-分泌酶与其底物都是跨膜蛋白，获得它们的稳定复合物是世界级难题。

“不能盲目相信它就是了，虽然蛋白分子大小与期望中的复合物一致，但也要反复求证。”杨光辉说，这是后面实验的基础，如果不对这一步“较真”，后面的实验是有风险的。

根据分子量的初步判断，就好像从两个人的体重分辨。为了在真身显露（上冷冻电镜）之前，再多加几成把握，团队从不同的角度开始验证。

“既然二硫键是在氧化条件下形成的，那么在还原条件下就应该能够解开，分别变成单体。”杨光辉说，实验证明了他们的猜想，变成单体之后的分子量也与早老素和底物的大小一致。

随后，团队还通过免疫印迹、质谱鉴定等方法分别对自己苦苦追寻到的复合物进行考察，最终每一个结果都成功地为复合物“加了分”。

高分辨率结构揭开复合物谜团

施一公团队完成了对γ-分泌酶与底物Notch的复合物结构解析，分辨率高达2.7埃（1埃等于0.1纳米），这是第一个γ-分泌酶与底物复合物的高分辨率结构，也是第一个膜内蛋白水解酶与底物的复合物结构。利用相似的策略，团队顺利获得了γ-分泌酶与另一个重要底物淀粉样前体蛋白（APP）的稳定复合物，并获得了其冷冻电镜结构。

在冷冻电镜的高分辨率结构中，一切细节被数万倍放大，相互作用的谜团也被一一揭晓。回过头看时，身为发现者，杨光辉也对生命机理的奇妙感到惊喜：“所谓眼见为实，真的是亲眼见到才敢相信酶和底物是这么作用的。”

“γ-分泌酶是一个跨膜蛋白，因为细胞膜的主要成分是磷脂，上面的蛋白应该是亲脂不亲水的，而它对底物的切割却需要水解，这是一个矛盾。”杨光辉进一步解释，酶却可以处理得很好。结构显示，在跨膜区靠近细胞内的一侧，早老素通过构象变化，与底物的胞内段形成稳定的β-sheet结构，为稳定底物提供了保证。底物被酶变化出的新结构β-sheet“锚定”住，同时“解旋”。原先被隐藏在“腹中”的“弱点”一下暴露出来，只等酶切。也正因为解旋的作用，亲水的基团得以出头，推动酶的水解工作完成。这一结构观察第一次直观证明了长久以来膜内蛋白水解酶酶切底物时，底物蛋白需要发生解旋的猜想。此外，根据得到的结构，研究组提出了γ-分泌酶结合底物并依次进行多步酶切的机理：底物的跨膜螺旋随着切割的进行逐步解旋，并与γ-分泌酶形成新的中间态复合物再次进行切割。

近年来，多数治疗阿尔茨海默症的方法是通过抑制γ-分泌酶的活性来减少淀粉样沉淀的，然而由于γ-分泌酶的“一酶多功能”，单纯地对其抑制甚至可能会抑制对Notch的切割，增加患上肿瘤的风险。精细地分析酶对不同底物关键作用位点的功能，将可能研发特异性抑制APP的切割而不影响Notch切割的药物。

来源：科技日报

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