2018年2月CRISPR/Cas最新研究进展

基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

即将过去的2月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下2月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。

1.两篇Cell表明利用一种基于CRISPR/Cas9的技术有望治疗脆性X染色体综合征

脆性X染色体综合征是由X染色体上的FMR1基因发生突变引起的。甲基化会阻止这个发生突变的基因表达。已证实在大脑发育期间，缺乏FMR1编码的蛋白会引起与这种综合征相关的神经元过度兴奋。如今，在一项新的研究中，来自美国怀特黑德生物医学研究所的研究人员首次使用他们开发的一种移除甲基化的改进型CRISPR / Cas9系统恢复了受这种疾病影响的神经元中的FMR1基因活性，这提示着这种方法可能经证实是一种靶向由异常甲基化引起的疾病的有用范例。相关研究结果于2018年2月15日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Rescue of Fragile X Syndrome Neurons by DNA Methylation Editing of the FMR1 Gene”。论文通信作者为怀特黑德生物医学研究所创始成员Rudolf Jaenisch。

图片来自Cell,doi:10.1016/j.cell.2018.01.012。

这项研究是首个直接的证据表明对FMR1基因的特定片段进行去甲基化能够重新激活这个基因，从而拯救受脆性X染色体综合征影响的神经元（以下称脆性X染色体综合征神经元）。

2.Science：利用CRISPR构建出细胞事件记录器---CAMERA

在一项新的研究中，来自美国布罗德研究所的Weixin Tang和David R. Liu开发出一种利用CRISPR构建细胞事件记录系统的技术。在他们于2018年2月15日在线发表在Science期刊上的标题为“Rewritable multi-event analog recording in bacterial and mammalian cells”的论文中，他们描述了这种技术和利用它开发出的两种记录系统。Jon Cohen针对这项研究在2018年2月16日的Science期刊上进行了讨论。

这两名研究人员报道他们开发出一种被称作CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus, CRISPR介导的模拟多事件记录装置）的技术，他们利用这种技术构建出两种类型的细胞记录系统。

在第一种被称为“CAMERA 1”的细胞记录系统中，这两名研究人员将两种彼此之间略有不同的质粒注射到细菌细胞中，随后在接触到所需的刺激物期间，利用CRISPR-Cas9对这两种质粒中的一种进行切割，从而诱导细胞产生另一种质粒来取代它。这样做就会在事件发生时记录它们。这种技术允许这两名研究人员记录细胞如何对营养物或抗生素等刺激物作出反应。

在第二种被称为“CAMERA 2”的细胞记录系统中，当所需的信号在细胞中发生时，这两名研究人员利用碱基编辑器（base editor）改变遗传密码中的单个碱基。利用这种技术，他们记录当接触病毒、营养物和抗生素等刺激物时，细胞如何作出反应。他们报道这种技术成功地用于细菌细胞和人细胞中。

3.Science：重大突破！开发出基于CRISPR的一次性多重核酸检测平台

在一项新的研究中，之前首次开发出一种快速而又廉价的高度灵敏的基于CRISPR的诊断工具---被称作SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）---的研究人员极大地增强了这种工具的功能，并且开发出一种微型试纸条测试方法，这种测试方法允许用肉眼观察到测试结果，而无需使用昂贵的设备。相关研究结果于2018年2月15日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”。

SHERLOCK取得成功的关键在于一种被称作Cas13的CRISPR相关蛋白，这种蛋白经编程后结合到一段特定的RNA片段上。Cas13的靶标能够是任何基因序列，包括病毒基因组、在细菌中赋予抗生素耐药性的基因或者导致癌症的突变。在某些情况下，一旦Cas13定位到并切割它指定的靶标，这种酶就会超速运转，从而不加区别地切割附近的其他RNA。为了开发出SHERLOCK，这些研究人员将这种“脱靶”活性转化为它的优势，从而设计出这种与DNA和RNA相兼容的系统。

SHERLOCK的诊断潜力依赖于额外的在遭受切割后产生信号的合成RNA链。在Cas13结合到它的初始靶标后，它会切割这种合成RNA，释放出信号分子，从而产生指示它的靶标存在或不存在的测量值。

SHERLOCK平台如今能够适用于测试多种靶标。SHERLOCK最初一次只能检测到一种核酸序列，但是如今一次分析能够同时为多达4种不同的靶标提供荧光信号---这意味着需要更少的样品用于诊断中。比如，这种新的SHERLOCK版本能够在单一反应中确定一种样品是否含有寨卡病毒或登革热病毒颗粒，这些病毒颗粒会导致患者出现类似的症状。这种平台利用来自不同细菌种类的Cas13和Cas12a（以前称为Cpf1）酶产生这些额外的信号。

4.Science：重大进展！开发出基于CRISPR-Cas12a的技术检测病毒DNA

一种强大的基因组编辑工具能够作为一种王牌DNA侦探进行部署，能够嗅出指示病毒感染、癌症或者甚至缺陷性基因存在的DNA片段。

Doudna说，这种被称作DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）的DNA侦探工具“能够实现灵敏而又准确的DNA检测”，并且能够在人类样品中发现两种致癌性的人类乳头状瘤病毒（HPV）。2017年11月，她和她的同事们首先在bioRxiv.org上发布了这项研究的预印本（doi:10.1101/226993）；相关研究也于2018年2月15日在线发表在Science期刊上，论文标题为“CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity”。

图片来自HHMI

这些研究人员观察到在某些情况下，Cas12a会变成一种DNA切碎机，将附近的任何单链DNA进行切割。但这不是滥杀滥伤。为了开始砍刀行动，Cas12a首先必须找到一个精确的DNA靶标。人们能够通过添加一个告诉Cas12a寻找什么的向导RNA分子来对这个靶标进行编程。Harrington说，“通过重新编程来发现你想要检测的任何DNA片段是非常简单的。”

一旦Cas12a锁定它的靶标并进行切割，它就会开始撕碎它能够发现的所有单链DNA。但是为了让这种系统变得有用，Doudna和她的同事们需要一种方法来观察Cas12a何时开始这种分子残杀，从而指示它已找到它的靶标。因此，这些研究人员使用了一种发光分子（一种易于发现的荧光分子），并且这种发光分子通过一种单链DNA与一种阻止这种发光分子发光的抑制分子连接在一起。当Cas12a开始砍刀行动时，它切割将这种发光分子和这种抑制分子连接在一起的单链DNA。这就移除了这种抑制分子，让这种发光分子发光---一种研究人员能够检测到的信号。

Doudna团队随后利用他们的DNA侦探进行测试。通过与加州大学旧金山分校的Joel Palefsky博士及其团队合作，他们寻找来自两种致癌性HPV---HPV16和HPV18---的DNA信号。这些研究人员获得了25份来自未感染上HPV、感染这两种致癌性HPV中的一种和同时感染上这两种致癌性HPV的人的DNA样品。对HPV16而言，DETECTR对这所有的25份样本都作出了正确的判断。对HPV18而言，DETECTR正确地判断了这25份样品中的23份。Doudna说，它错过的样品信号比较弱，可能能够通过设计不同的向导RNA加以改进。

5.Science：挑战常规！利用基于CRISPR/Cas9的DNA标记技术观察动态的DNA舞蹈

DNA在转录期间发生抽动，让相距较远的基因组区域接触，从而增强基因表达。在一项新的研究中，来自美国斯坦福大学的研究人员开发出一种新的方法来标记单个非重复性的DNA序列。相关研究结果于2018年1月25日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Transcription-coupled changes in nuclear mobility of mammalian cis-regulatory elements”。

这种新的DNA标记技术能够利用荧光分子精确地标记任何单个DNA片段，并追踪它们的三维位置和运动，从而允许揭示出这种DNA舞蹈。这些研究人员将这种技术称为嵌合gRNA寡核苷酸阵列（chimeric array of gRNA oligo, CARGO）。它是CRISPR/Cas9基因编辑工具的一种变体，有望引发基因组动力学研究变革。

Guys、作为论文第一作者的研究生Bo Gu和另一名论文共同作者Tomasz Swigut博士设计了一种方法：将由许多不同的gRNA组成的阵列导入细胞中，从而精确地识别独特的非重复性DNA片段并利用多种荧光分子对它们进行标记，这样就能够在显微镜下很容易地可视化观察到它们。

6.Cell Rep：解释为何CRISPR-Cas9存在脱靶效应

Cas9蛋白的发现简化了基因编辑，甚至可能在不远的将来消除很多遗传性疾病。利用Cas9，科学家们能够切割细胞中的DNA，从而校正发生突变的基因，或者将新的遗传物质导入到这个新被切开的位点上。最初，CRISPR-Cas9系统似乎是非常准确的。然而，如今，显而易见的是，Cas9有时也切割与它靶向的序列相类似的其他DNA序列。在一项新的研究中，来自荷兰代尔夫特理工大学的研究人员开发出一种数学模型来解释为何Cas9会切割一些DNA序列，同时又让其他的DNA序列保持完整。相关研究结果发表在2018年2月6日的Cell Reports期刊上，论文标题为“Hybridization Kinetics Explains CRISPR-Cas Off-Targeting Rules”。

Depken解释道，“当Cas9查验一种DNA序列是否匹配时，它从这条链的一端开始查验。 随后，它会依次查验这条链中的所有碱基。对于每个碱基匹配，Cas9都会获得能量，而任何不匹配都会消耗能量。一种DNA序列包含的不匹配的碱基越多，并且这些不匹配的碱基越接近这种序列的开始处，Cas9就越不可能对它进行切割，相反，它将从DNA中脱落下来并继续寻找一段能够更好地匹配它的RNA模板的DNA序列。

根据Depken的说法，令人吃惊的是，他的团队开发的这种简单数学模型非常好地预测了现有的关于Cas9切割行为的数据。如果不匹配的碱基位于一段DNA序列的末尾，那么为了增加切割的可能性，Cas9可能需要汇聚足够的能量来克服这一障碍。该模型还解释了当Cas9在一段DNA序列的起始处遇到不匹配的碱基，或者两个不匹配的碱基挨得很近时，它为何不能对这段DNA序列进行切割。

7.Angew Chem：突破！会动的纳米马达让CRISPR-Cas-9钻进癌细胞心窝进行基因编辑！

在癌症研究领域，”Cas-9–sgRNA“复合物是一种有效的基因编辑工具，但是其穿过细胞膜接触肿瘤细胞基因组的能力非常低。来自美国和丹麦的科学家们现在开发了一种可以运动的纳米马达，可以有效输送并释放这种基因魔剪系统。在这篇发表于《Angewandte Chemie》的文章中，研究人员详细描述了他们开发的超声驱动的纳米马达。

基因工程是一种有潜力的癌症治疗手段，在适应性细菌免疫防御系统”CRISPR“发现之后经历了蓬勃的发展。目前用于基因编辑的工程化CRISPR系统包含两个组分：一个单链引导RNA（sgRNA）和Cas-9核酸酶，其中sgRNA可以引导Cas-9核酸酶结合特异的基因序列，随后核酸酶发挥其基因编辑功能。然而输送这个庞大的基因编辑系统进入细胞存在一定问题。该研究通讯作者Liangfang Zhang 和Joseph Wang来自加州大学圣地亚哥分校（UCSD），他们及其同事现在开发出了一种超声驱动的纳米线，可以主动将Cas9–sgRNA复合物运输穿过细胞膜进入细胞。

金纳米线可以被动穿过细胞膜，但是由于它们的特殊不对称形状，超声可以促使它们主动运动。”金纳米线马达的不对称形状对于超声驱动是必不可少的。“作者强调道。他们把该纳米马达与Cas9–sgRNA复合物通过硫键结合在一起。这些可还原的化学键在肿瘤细胞内具有优势，它们可以被癌细胞内丰富的天然还原性物质谷胱甘肽打断，这就促使Cas9–sgRNA复合物被释放进入细胞核发挥作用，如敲除基因。

作为一个测试实验，研究人员检测了表达绿色荧光蛋白的黑素瘤细胞B16F10中的荧光强度变化。他采用超声对细胞处理5分钟，这可以加速携带Cas9–sgRNA复合物的纳米马达穿过细胞膜进入细胞。他们发现他们的Cas9–sgRNA复合物可以在很低浓度下有效抑制荧光蛋白的表达。

8.Nat Microbio：重大发现！科学家发现新的CRISPR/Cas9系统！

CRISPR/Cas9是一种很有潜力的基因魔剪，可以对植物、动物以及微生物基因组中特定的DN序列进行基因编辑，甚至可以用于修复基因突变。近日一个由德国弗莱堡大学Juliane Behler和Wolfgang Hess教授领导的研究团队发现了一种新酶——一种涉及CRISPR/Cas9系统以及调节基因正常表达的特殊RNA剪刀。相关研究成果发表在《Nature Microbiology》上。

天然的CRISPR/Cas9系统发现于大多数细菌和古生菌中，它们组成了细菌的免疫系统以保护细菌免受病毒的伤害。为了保护细菌，一条长的RNA分子会首先被切成很多更小的单元。随后一种酶就可以使用一对RNA剪刀去剪切RNA分子以保护细菌。天然的CRISPR/Cas9系统通常自行工作：它们会在不同的细菌间快速交换，同时不依赖于宿主的其他蛋白。当然现有流行的CRISPR/Cas9系统中也有例外，某些系统会使用宿主的RNA酶3作为RNA剪刀。

而来自弗莱堡大学的科学家们现在发现RNA酶E也可以作为蓝藻细菌中CRISPR/Cas9系统的RNA剪刀。这种酶非常常见，不仅出现在光合成蓝藻细菌中，同时还出现在一些致病的细菌和植物叶绿体中。它是所有这些物种正确调节基因表达的重要因子。但是迄今为止还不清楚的是它是否在CRISPR/Cas9系统中也发挥作用。

9.Genome Res：加强版CRISPR-Cas9：可更精准编辑基因！脱靶效应大大降低！

基因疗法是治疗基因突变导致的疾病的一种新型策略。一种基因疗法涉及使用基因编辑技术CRISPR-Cas9直接修复缺陷基因。尽管它具有治疗潜力，但是也会导致不想要的甚至是有害的基因错误，因而限制了它的临床应用。在一项最近发表于《Genome Research》上的新研究中，来自大阪大学的研究人员发现了一种改进版的CRISPR-Cas9系统，能够在显着降低编辑错误的情况下进行基因编辑。

CRISPR-Cas9系统通过将Cas9蛋白（切割DNA）和短的引导RNA（sgRNA，告诉Cas9该切割的地方）结合发挥效应。这两种分子结合在一起可以靶向基因组中的任何基因进行编辑。但是更大的挑战在于如何靶向编辑基因实现特殊的基因变化。

”问题在于Cas9切割很难以精准的方式修复。“Nakada说道。”因此我们使用了一种改进版的Cas9，仅仅攻击一条链。我们发现当我们把靶基因和供体DNA结合后，我们能够更精准地修复靶基因。“

研究人员发现与传统技术相比，这项技术可以显着降低意外的基因突变。在一项实验中，传统技术在超过90%的情况下都会产生意外突变，而这项新技术产生意外突变的情况低于5%。值得注意的是，这项精准技术并没有牺牲基因编辑的效率。

10.Sci Adv：重磅！科学家利用CRISPR/Cas9技术成功治疗杜氏肌营养不良症

近日，一项刊登在国际杂志Science Advances上的研究报告中，来自美国和德国的科学家们通过研究描述了一种新的CRISPR方法，这种新方法或许有望利用杜氏肌营养不良（DMD）症患者机体的多能干细胞来产生健康的心肌，这种新方法还克服了此前研究人员对DMD细胞进行基因编辑时遇到的多种问题。

由于该疾病是基于基因突变而诱发，因此其或许能够成为CRISPR技术成功治疗的下一个顽疾，但问题是该疾病的发生往往是基于大量基因突变（将近3000个）所产生，为了克服这一问题，研究者运用了一种名为”myoediting“的技术，在该技术中CRISPR主要会被靶向作用基因突变的热点区域，从而就能有效对整个基因簇进行编辑和修复。

这项研究中，研究人员还从DMD患者机体机体开发出了诱导多能干细胞，随后这些细胞被进行了特定修复并且重编程使其能够成长为心肌细胞，最后产生肌营养不良蛋白；通过为多个细胞搭建”支架“，研究者就能够制造出少量的心肌组织，同时他们还发现，所产生的心肌组织不仅能够跳动，还能够因肌营养不良蛋白的产生而持续保持健康。

来源：生物谷