基因治疗——即将到来的医学革命

21世纪是生物科学与生物技术的世纪。随着转基因技术、反义核酸技术、RNAi技术等基因操作方法的发展与完善，采用分子生物学手段治疗遗传疾病、肿瘤、心血管和代谢性疾病等已成为本世纪的一大热点领域。从1990年美国FDA批准第1项人类基因治疗的临床试验方案至今，基因治疗的研究已经走过了接近30年的历程，其研究迅速发展,已取得很多突破。作为一项跨世纪工程，其受到科学界越来越多的关注，目前已有少数有确切疗效的临床试验。

1前  言

早在45年前，基因治疗先驱西奥多·弗里德曼（Theodore Friedmann）就提出单基因遗传病可通过给病人提供正确的基因来治疗[1]。从原理上来说，基于蛋白的疗法需要反复给药（例如糖尿病人需要一直注射胰岛素），而如果可修复病人的错误基因或直接提供正确的基因，那么单次治疗就有可能产生持续的治疗效果。

基因疗法的发展之路漫长而曲折，在早期临床研究中遇到的严重不良反应，促使基因治疗研究转向更安全、更有效的基因转移载体。经过三十年探索，通过修改DNA来治疗疾病的基因治疗方法不再是未来医学，而是当今临床治疗工具的一部分，正在为医学领域带来多个新的治疗选择。

2什么是基因治疗

基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。

3基因治疗发展史

基因治疗概念的形成有着非常悠久的历史，最早可以追溯到1963年，刚好是DNA双螺旋结构发表10年，获诺贝尔生理学或医学奖1年之后，美国分子生物学家、诺贝尔生理学或医学奖获得者乔舒亚·莱德伯格（JoshuaLederberg）提出了基因交换和基因优化的理念。20世纪七八十年代，限制性内切酶、DNA连接酶和逆转录酶等相继被发现，基因重组工程技术得到发展，病毒载体出现，基因治疗的技术体系初步具备。1972年，美国着名生物学家西奥多·弗里德曼（Theodore Friedmann）等人在《Science》杂志上发表了一篇被广泛认为具有划时代意义的前瞻性评论《基因治疗能否用于人类遗传病？》，提出了基因治疗是否可以用于人类疾病治疗的设问。

随着基因体外扩增，尤其是PCR（聚合酶链式反应）技术的出现和完善，基因克隆技术日臻成熟，DNA重组技术和病毒载体也得到进一步发展，分子生物学和细胞生物学开始进入黄金时期。截至1990年，来自多个研究组的一系列工作令人信服地验证了病毒介导的基因纠正和替代的可行性与有效性。

历史上首例基因疗法的临床试验是由NIH的威廉·弗伦奇·安德森（William French Anderson）医生领衔的针对重症联合免疫缺陷病（SCID）的基因治疗。安德森和合作者们首先从4岁女孩阿莎提·德席尔瓦（Ashanti DeSilva）体内抽取白细胞，然后在体外利用逆转录病毒载体将能够正确编码腺苷脱氨酶的ada基因插入到德席尔瓦的白细胞基因组中，最后将这些基因工程改造后的白细胞重新输回德席尔瓦体内，这一案例在基因治疗发展史上无疑是一个极其重要的里程碑。

然而，在基因治疗临床试验的早期，发生过没有疗效或产生意外的毒性导致某些病例死亡案例，导致基因治疗进入寒冬[2]。1996，美国国立卫生研究院（NIH）咨询小组得出结论，这些令人失望的临床结果是由于对病毒载体、靶细胞和组织以及疾病的认识不足造成的。咨询小组建议研究人员重返实验室，关注基因治疗方法的基础科学研究[3]。新载体的开发和对靶细胞的进一步了解，引发了20世纪90年代末和21世纪初的第二代临床试验。这些试验证明，在某些情况下，靶组织持续的基因修饰可以获得临床获益。然而，由于基因转移效率高导致的严重毒性，使基因治疗的进步再次放缓；例如：插入基因毒性，转基因细胞的免疫破坏，某些载体相关的免疫反应[2,4,5]。

在过去的10年中，基因治疗在“科学”研究、安全性的改进，基因转移效率和输注的进一步成熟，最终推动了大量的临床进展。美国和世界各地的监管机构，已经批准一些基因和基因修饰的细胞疗法成为药物，还有十多项获得了“突破疗法”称号。基因治疗目前的研究方向主要集中在基因传递载体、基因编辑以及CAR疗法等。

4基因传递载体

基因治疗这项生物医学技术要求将目的基因运输到靶细胞，进而将目的基因运输到细胞核部位。因此，基因治疗的关键技术是基因传递载体的设计。基因治疗中常用的载体有病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等；非病毒载体主要是纳米载体和高分子载体。

腺病毒载体 Adenovirus vector

腺病毒载体是目前临床基因治疗中使用最多的载体，占所有使用的基因治疗载体24％。腺病毒载体在基因治疗中的优点有：方便——可以多种途径给入，如肌注、静注、口服和雾化吸人；安全性好。经临床及实验研究证实，常用的5型腺病毒无致病及致癌作用，不会引起癌基因激活。宿主范围广。

然而，它缺乏特异靶向性，在一些缺乏其相应受体的细胞中感染效率低。现在很多实验室在构建靶向腺病毒载体，它们主要针对腺病毒天然噬性进行改造，从而只对特异性受体具有靶向性[6]。在体内应用时产生的免疫反应也限制了它的应用，空壳载体删除了病毒基因组，只保留了ITRs及包装信号，也称为裸腺病毒载体，是第3代腺病毒载体，以第三代腺病毒为载体在进行基因治疗中具有重要意义[7]。

逆转录载体 Retroviral vectors

逆转录病毒(Retrovirus)是一类已知的RNA病毒。逆转录病毒载体最大优点是：转染谱广，可以感染各种细胞类型；转入的外源基因可完全整合；对细胞感染率高，达到100％；感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。根据报道利用逆转录病毒作为载体来进行血友病A的基因治疗已经有了很大的进展[8]。

二十世纪80年和90年代早期，证明开发的g型-逆转录病毒载体可以将基因导入再生的造血干细胞。C型-逆转录病毒可以将有效的基因导入原始T淋巴细胞。第一代的临床试验设计使用这些载体，转移一个特定的缺陷基因进入免疫缺陷病或癌症患者的T细胞或造血干细胞的基因组[9]。

造血干细胞基因治疗历史如（图1）所示。其中，γ逆转录病毒载体(一般由小鼠白血病病毒MLV改造而来)是最早被改造的且最广泛地被应用到基因治疗当中。

慢病毒是属于逆转录病毒的成员之一，它的特点是可以感染分裂期和静止期细胞。而且与其他载体相比，慢病毒载体的免疫原性比较低。同样，它也可以整合基因至宿主细胞中使其长期稳定表达。因此，慢病毒在基因治疗中具有良好的应用前景。

来源：Science

其他病毒载体

除上述常用的病毒载体外，应用于基因治疗的载体还包括腺相关病毒，单纯疱疹病毒，痘病毒和溶瘤病毒。其中腺相关病毒最常用于眼部疾病的基因治疗，如遗传性视网膜退行性病变。腺相关病毒(AAV)载体作为基因转移载体具有安全性好、宿主范围广、转染和表达效率高、目的基因长期表达等优势，是视网膜色素变性基因治疗领域最具潜力和应用价值的病毒载体[6]。AAV载体来自于一种非致病性，无包膜的细小病毒，天然具有复制缺陷。AAV载体的一个限制是，不能容纳超过5 kb的DNA（g-retroviral或慢病毒载体，可容纳>8 kb DNA）。AAV载体主要是非整合性型；转移的DNA作为游离基因是稳定。这一特点降低了整合风险，也限制了腺相关病毒载体在有丝分裂后细胞内的长期表达。

非病毒载体

非病毒载体具有成本低、制备简单、便于大规模生产、安全性高、外源基因长度不受限制等优点。最简单的非病毒基因转移系统是裸DNA，可直接注入特定的组织，特别是肌肉，造成较高水平的基因表达。目前，正在研究的非病毒载体还有聚合物(聚-L一赖氨酸、聚乙烯亚胺等)、复合载体以及纳米粒子载体等。

基因组编辑

与病毒载体仅可以介导一种基因修饰（“基因添加”）不同，新的基因组编辑技术可以介导基因添加、基因删除、基因校正，以及细胞内其他高度靶向的基因组修饰。基因组编辑可以在体外细胞上进行，也可以在体内进行原位基因组编辑。靶向DNA替代是由一个核酸酶诱导双链DNA断裂引发（DSB），可以激活哺乳动物细胞中的高效重组。非同源末端连接（NHEJ）–介导的修复，可以在DSB位点有效的产生不同长度的插入片段或删除突变（InDel），通常导致基因功能失活。同源定向修复（HDR），在同源供体DNA模板的存在下产生特定的替代序列，重组后在特定位点纠正突变或插入新序列。

早期的基因组编辑研究，依赖于特定的锌指核酸酶（ZFN）[10]或超级核酸酶[11]，在DNA靶位点诱导所需的DNA双链断裂（DSBs）。这些核酸酶平台需要专门的知识，定制特异的结合核酸酶效应蛋白切割靶DNA，这限制了锌指核酸酶的广泛应用。2009年证实，细菌蛋白的DNA结合区称为转录激活效应区（TALEs）很容易改变，为产生TALE核酸酶（TALENs）打开创造之门[12,13]。这些酶能有效地切割任何感兴趣的DNA序列。然而，TALEN的方法仍然需要为每个新的靶向DNA设计两条特定的核酸酶。

2012年，基因组编辑发生巨大的改变，Doudna和Charpentier开创性的发现，细菌防御系统由成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）–CRISPR 相关核酸酶9（cas9），CRISPR- Cas9核酸酶可以有效地、程序性切割DNA位点，只需设计一条与感兴趣的目标位点互补的、特定的、短链指导RNA（gRNA）。CRISPR-Cas9核酸酶技术迅速扩展到哺乳动物细胞，从而简化基因组编辑过程。TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶，可以很容易地重编程切割特定的DNA序列，现在广泛用于无数的基础研究中[14-16]。

基因组编辑方法为纠正或改变基因组提供了一个精确的手术刀，可以克服依赖于病毒载体介导的半随机基因组插入策略的许多缺点。

基因组编辑作为一种治疗手段正在迅速发展到临床。

5CAR-T 疗法

工程T细胞正在成为强有力的癌症工具（CAR-T细胞治疗如图3所示）。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptors，CARs)是人工合成的基因工程受体，抗原，在一个单一的分子中整合了T淋巴细胞的特异性、功能和代谢[17,18]。CAR由抗原结合结构域，来自于一个免疫球蛋白分子或一个T细胞受体，融合为一个细胞内信号转导结构域，介导激活和共刺激以增强T细胞功能和持久性。与抗原的生理受体不同，CARs可以被工程化设计，识别蛋白质和碳水化合物的糖脂，以及HLA多肽复合物。CAR-T细胞疗法，全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种细胞治疗方法，它是在T细胞上加上一个“嵌合抗原受体”，“嵌合抗原受体”由“GPS导航”（胞外抗原识别区）和“激活按钮”（胞内信号转导区）组成， 而CTL019或者说CAR-T 019，实际就是加上了一个可以识别肿瘤细胞表面“CD19”的一个抗原受体，当“GPS导航”定位到肿瘤抗原并与之结合，之后“激活按钮”就开始激活T细胞，从而对肿瘤展开杀戒。说白了，就是给我们自己的“军队”加上一个可以精准识别“敌人”的“大杀器”，这批经过“改造”后的“特种部队”回输到人体后，就可以毫不费力地找到带有特殊标记的“敌人”，并将之全部剿灭。

来源：Science

CD19 CARs在难治性ALL和难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）临床受益，2017 年，FDA批准两个基因工程细胞的产品，是美国首次批准。目前的研究目标是将CAR治疗扩大到髓系恶性肿瘤和实体瘤。这些疾病带来了挑战，因为可靠的肿瘤特异性细胞表面抗原尚未得到验证。此外，需要一个方法，有助于CAR-T细胞进入较大肿瘤或免疫特权区域，克服肿瘤微环境信号。通用第三方CAR-T细胞，可以使用“现成的”CAR-T细胞，与患者的自身特异性T细胞相比，将提供更快速和更便宜的治疗。T细胞缺乏内源性T细胞受体和/或主要组织相容性复合体分子，以减少GVHD和排斥的风险，在临床前或早期临床研究，作为迈向这一目标的第一步。CAR-T细胞已经对某些癌症治疗具有很大的影响，这一成功为未来T细胞为基础的治疗其他癌症和其他疾病如自身免疫性疾病和艾滋病的治疗提供了基础。

6结  论

经过二三十年的失败、探索、再失败、再探索的螺旋式进展，基因治疗开始进入高速发展的阶段，其安全性和有效性开始得到医药监管部门和医药巨头的认可。世界范围内，制药巨头葛兰素史克、诺华、辉瑞、赛诺菲等纷纷通过收购或合作进入基因治疗领域，投入基因治疗药物上市前最后阶段的推动中。传统制药巨头的参与极大地推动了基因治疗临床试验的开展，基因治疗公司开始成为纳斯达克投资人的宠儿。然而，未来仍有很多挑战，包括解决整合基因载体的遗传毒性或关闭靶向基因组编辑，提高基因转移水平或基因组编辑效率，解决体内对载体的免疫反应，并对如基因组编辑的伦理争议和昂贵的治疗费用等问题达成社会共识等。

基因治疗将是医学史上的一次革命，因为人自己、甚至人的疾病组织(如肿瘤)本身成为“基因工程的药厂”，生长出的药物(基因产物)治疗人的疾病。但是，关键问题是何时才能实现。

尽管目前对于基因治疗还有许多技术难题有待解决，但可以相信：随着人类基因表达调控机制的阐明，以及转基因技术的发展和转基因方法的完善，基因治疗必将成为21世纪人类攻克疑难病症的一种常规治疗手段。

来源：火石创造

作者：刘磊

来源：火石创造   作者：刘磊