张锋团队发现第三个可用于人类基因组编辑的CRISPR-Cas系统

日前，科学家报告了第三款可用于人类基因组编辑的CRISPR-Cas系统--CRISPR-Cas12b。

CRISPR-Cas基因编辑系统先驱之一、美国麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所张锋团队，麻省理工学院麦戈文脑研究所及国立卫生研究院的研究人员共同发文证明，CRISPR-Cas12b可精确切割或编辑人类细胞基因组，同时具有高靶特异性和小尺寸，与Cas9系统相比，更适于体内应用，该研究发表在《Nature Communications》杂志上。

CRISPR基因编辑技术及其相关应用是近年生命科学领域备受关注的热点研究方向，基于CRISPR技术，科学家可高效、快速、便捷地对基因进行编辑。

目前CRISPR系统中有两类效应蛋白家族--Cas9和Cas12a，已被成功改造用于人类细胞的基因组编辑，然而事实上，还有一个极富潜力的成员，就是Cas12b。Cas12b蛋白通常比Cas9和Cas12a更小，更容易通过病毒载体实现细胞间递送，但Cas12b具有嗜高温特性，作为DNA裂解酶的最佳活性需要高达48℃，因而在人类细胞中的应用受限。

Cas9、Cas12a、Cas12b三种核酸酶的位点图和蛋白结构（图片来源：Nature Communications）

Cas12b来自生活在温泉、火山和深海热液喷口等热环境中的高温细菌，张锋表示，“我们希望从自然中发现灵感，研制出一种能在较低温度下工作的Cas12b，我们扫描了数千个细菌基因序列，寻找能在哺乳动物环境较低温度下茁壮成长的细菌。”

“我们测量了两个目标位点的插入缺失活性，共有176个BhCas12b单突变体，发现几个突变的活性增加，包括K846R和S893R，它们作为双突变体表现出增强效应，”作者写道。“最终确定的BhCas12b v4突变体，其中含有K846R/S893R/E837G，在多个靶标上表现出最高活性。”

用纯化的Cas12b蛋白体外重组Cas12b系统，通过RNA-Seq鉴定合成crRNA和tracrRNA。（图片来源：Nature Communications）

为了解决这个问题，研究者对Cas12b进行了工程改造，根据蛋白质晶体结构的线索，研究人员通过4个点突变，得到了重新设计的新Cas12b，让酶的活性位点更容易和DNA靶序列接近。

通过对Cas12b的研究，研究人员发现BhCas12b可在人体体温37℃时保持核酸酶活性，但原始结构的野生型BhCas12b会优先切断非靶DNA链，且温度越低、错误越多。为解决这一问题，研究人员通过蛋白质工程技术对Cas12b进行了改造，通过4个点位突变，让酶的活性点位更容易和DNA靶序列接近，增强了其在37℃下的活性。

在细胞培养实验中，通过对改造后的BhCas12b针对多个基因的多个靶序列进行编辑效率检测，研究证实BhCas12b具有更高的特异性，其编辑效率与Cas9、Cas12a相当，甚至更高。在人类细胞测试中，改造后的BhCas12b在37°C时表现出增加的双链DNA切割活性，并且在不同的Cas核酸酶之间选择的9个具有可比活性的靶位点中，BhCas12b没有发现任何的靶外位点，这极大地降低了CRISPR技术最大的隐患之一--脱靶效应。

BhCas12b具有高度特异性（图片来源：Nature Communications）

作为第三个可用于人类基因组编辑的CRISPR-Cas系统，Cas12b未来可期。“这进一步证明，还有许多有用的CRISPR系统有待发现，”该研究的第一作者、人类前沿科学项目研究员Jonathan Strecker说道。

事实上，自从Cas12b酶家族在2015年首次被描述并被证明是RNA引导的DNA内核酸酶以来，有几个小组一直在探索这个酶家族。2017年，加州大学伯克利分校Jennifer Doudna实验室的一个研究小组报告称，酸杆菌Cas12b可以在体外介导DNA的非特异性侧枝分裂。

另外，值得一提的是，2018年11月27日，中国科学院动物研究所李伟团队在《Cell Discovery》发文，表示已鉴定出若干能在人体生理温度工作的Cas12b/C2c1酶，且经过系统改造，有两种Cas12b酶被成功开发成为哺乳动物基因组编辑工具，能够编辑人类细胞基因组并应用于制备动物疾病模型。

文章表示，Cas12b酶有若干优势与特点：Cas12b比应用最为广泛的SpCas9和Cas12a更小，因此更容易用于需要在体递送的基因治疗；Cas12b能够在宽广的温度范围和pH范围保持高的酶活性，有望适用于具有不同生理温度的多个物种。同时与SpCas9相比，Cas12b核糖核酸酶（RNP）在人血浆中更稳定；Cas12b很难耐受向导RNA与靶DNA之间的碱基错配，因此比SpCas9和Cas12a的脱靶效应更小，这意味着它在进行基因组编辑时更加安全。

针对这项新技术，该研究团队已于一年前提交了专利申请，并正在开发这项技术在基因治疗中的应用。

参考文献

《Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing》

《Scientists engineer new CRISPR platform for DNA targeting》

医谷链

《Science深度综述：CRISPR/Cas指引基因工程的未来》

来源：医谷网   作者：周会棋（编译）