Science：CAR-T大牛Carl H. June长文探讨CAR-T在肿瘤治疗中的研究进展、发展机遇和挑战

嵌合抗原受体（CAR）T细胞免疫疗法来源于过继性T细胞疗法（ACT），现在有三种形式的ACT用于癌症治疗，包括：肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）；T细胞受体（TCR）T细胞；CAR T细胞。

得益于细胞工程技术的快速进展，使得嵌合抗原受体（CAR）T细胞免疫疗法在肿瘤临床中除顽固肿瘤外均取得了持久的临床疗效，表现出了巨大的潜力。更令人鼓舞的是，自体T细胞工程表达嵌合抗原受体（CAR），CD19B淋巴细胞分子近期被FDA批准用于治疗顽固性前-B细胞急性淋巴细胞白血病和扩散大B细胞淋巴瘤。

2018年3月23日在Science杂志上发表的最新关于（CAR）T细胞免疫疗法的综述文章《CAR T cell immunotherapy for human cancer》。向我们着重介绍了CAR T细胞疗法的前景、在实体瘤治疗中的应用和在使用和商业化中出现的新差距等内容。本文将针对性探讨当前CAR-T细胞疗法在肿瘤研究中的进展、机遇和挑战。

T细胞基因改造： TCR和CAR T细胞免疫治疗的对比

图1. T细胞基因改造：TCR和CAR T细胞的设计（图片来源于参考文献）

1. TCRs疗法

TCRs包括一个α和β轻链与T细胞表面CD3复合物非共价结合。当TCR识别肽非共价结合抗原提呈细胞或肿瘤细胞表面的MHC时发生T细胞活化。 先前开发的用于对抗转移性黑色素瘤的TCR T细胞免疫疗法，例如结合人淋巴细胞抗原A2 （HLA-A2）-来源于黑色素细胞分化抗原的限制肽的TCRs，以及具有更高亲和力的TCR靶点MART-1的TCRs，尽管证明了疗效有改善，但是也带来了对皮肤、眼和耳蜗正常黑色素细胞的靶向损伤。但是有一半以上的治疗患者却可以避免上述肿瘤毒性，提示靶向共享抗原时，有效性与毒性之间的界线可能很狭窄。此外上述两个TCRs疗法伴随着致死性神经和心脏毒性，与癌睾丸抗原MAGE-A3直接相关，这也进一步突出了面临的挑战。

然而目前正在进行晚期临床评价的NY-ESO-1 T细胞疗法（NCT01343043）似乎带来了新的希望。 癌睾丸抗原NY-ESO-1靶向表达T细胞则表现出更高的TCR亲和力，特别是对HLA-A2限制肽，并且临床疗效明显，无毒性反应。 这让我们重新燃起了希望—对于所有共享抗原靶点，治疗窗口可能并不那么狭窄。开发具有特定肿瘤新抗原特异性的TCR T细胞疗法，可能比共享抗原的安全性更高，但是临床上并未进行验证。

2. CAR疗法

CAR结合抗原结合域通常是来源于具有TCRζ链信号区域和包含如CD28、OX40和CD137等受体的附加共刺激区域的抗体的可变域的单链可变片段（scFv）。CARs克服了TCRs的一些限制，如需要MHC的表达、识别和共刺激等。 CAR独立于MHC识别限制的特性赋予了CAR T细胞抗肿瘤的有利基础，因为大部分的肿瘤免疫逃逸机制均表明肿瘤细胞已经失去了MHC-相关的抗原提呈。当前CAR T细胞疗法的一个限制就是它们需要识别肿瘤细胞的外表面靶点。

B细胞恶性肿瘤—CAR T细胞的意外收获

在第一代CAR设计进行的临床试验中，对于多种肿瘤的治疗结果均令人失望。2011年，第二代CAR T细胞靶向CD19和编码共刺激结构域成为了T细胞基因改造方法治疗肿瘤的模板。其特征使得CD19成为几乎理想的靶标。它显示出在B细胞恶性肿瘤中的常见性和高水平表达，而且需要人体正常B细胞的发育，但是不表达B细胞系以外的细胞谱。采用CD19 CARs成功治疗的患者通常表现出显着的B细胞发育不良，因此CAR T细胞治疗后的B细胞缺失，主要通过静脉注射免疫球蛋白的替代疗法进行改善。

早期关于CAR T细胞作用于其它靶点的试验结果表明，CD19引发的非肿瘤交叉反应并非特例，但是可能在其它同系靶点中也观察到相同反应。例如多发性骨髓瘤表达低水平CD19，采用CD19 CAR T细胞治疗也有效。正在进行的CARs靶向B细胞成熟抗原（BCMA或CD269）的晚期骨肉瘤临床试验（NCT 02546167）中，除了恶性骨肉瘤细胞外，表达BCMA的良性浆细胞也被清除。非肿瘤反应的耐受程度主要依赖于靶向非癌细胞的类型。通过CD19-特异CAR T细胞疗法，大部分白血病复发患者达到完全治愈，但也出现了两种耐受类型。一类是缺失CART细胞靶向CD19抗原表位的急性白血病，导致肿瘤逃逸。全球临床试验中，CD-19阴性缺失变异的年轻和儿童急性白血病患者的复发率通常达到28%。另一类是慢性淋巴细胞（CLL）白血病，CLL的耐受可能是由于CART细胞注射后的增殖失败。

CAR T在B细胞之外的应用

现今CAR T的应用已不仅仅局限于CD19。在早期靶向多发性骨肉瘤的BCMA和急性淋巴白血病的CD22的临床试验中，CAR T细胞疗法均表现出相似的抗肿瘤活性。然而，正如CD19对B细胞系一样，BCMA和CD22也存在着高度限制，其存在的组织会出现靶向毒性。迄今为止，靶向肿瘤相关抗原的尝试取得的成功十分有限。

ERBB2/HER2蛋白作为酪氨酸激酶受体一员，在肿瘤中经常过表达，也是抗体或抗体-药物偶联治疗的确证靶点。首次采用CAR T细胞靶向治疗ERBB2/HER2患者时出现了致命性的毒性。通过使用具有基于赫赛汀和CD28和4-1BB细胞内信号传导结构域的高亲和力scFV的第三代CAR，揭示出毒性主要是由于识别和杀死肺上皮细胞表达低密度的ERBB2阳性细胞所致，引发肺衰竭和大量细胞因子释放。含有scFv的较低剂量CAR T细胞疗法较赫赛汀为基础建立的CAR的亲和力更低，治疗骨肉瘤的安全性较好，但只有轻度的临床活性。

靶向表达肾细胞癌碳酸酐酶IX （CAIX）抗原的第一代CART细胞疗法在I期临床试验中也遇到了意想不到的肝毒性。 原因是由于正常胆道上皮细胞CAIX抗原的低密度表达，并且在非临床试验中未发现该毒性。研究进一步表明该疗法具有潜在的肿瘤抗原相关的靶向非肿瘤毒性。

在临床试验中，CARs靶向其它共享抗原相关实体瘤包括间皮素、癌胚抗原和GD2神经节苷脂时并未显示出值得关注的毒性，但试验中的临床抗肿瘤疗效也被限制到最低。GD2-特异CAR T细胞在临床前试验中随着抗肿瘤活性的增强出现致死性神经毒性。局部注射靶向白介素-13受体α2的CAR T细胞治疗多形性胶质母细胞瘤时未出现静脉注射的预期毒性，表明需要关注一些抗原瘤内注射给药方式。

肿瘤微环境是ACT成功治疗的另一障碍，特别是实体瘤。 抑制T细胞免疫的途径，包括肿瘤免疫检查点（如PD-L1的表达），改变肿瘤代谢微环境（如缺氧或吲哚胺-1-氧化酶和精氨酸酶的表达），调节T细胞和抑制髓样细胞。ACT治疗后出现许多免疫和代谢检查点增加，显现出一定的耐受性。

联合PD-1/PD-L1-抑制抗体和CD19特异CAR T细胞治疗的临床试验正在进行（如NCT02926833，NCT02650999和NCT02706405）。除了联合其他的免疫检查点抑制剂，另一种治疗方式，中断抑制途径如转染受体或剪切基因也正在进行。

CAR T细胞疗法的毒性

尽管ACT激活T细胞会导致一定程度的免疫刺激和炎症，但是CD-19特异性，BCMA特异性和CD-22特异性CAR T细胞均观察到严重的细胞因子释放并发症（CRS）。该症状较TIL-和TCR疗法常见的流行性感冒样并发症更加严重。CAR T细胞引发的CRS严重程度与肿瘤负担相关。在大部分严重型患者中，CRS多数表现为嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症和巨噬细胞活化综合征的特征。
图2 CAR T细胞治疗伴随细胞因子释放并发症和神经毒性（图片来源于参考文献）

尽管CRS是T细胞免疫疗法的预期毒性，但是在临床试验中仍观察到CD19和BCMA特异性CAR T细胞治疗中出现的轻度到重度的神经系统症状。发生T细胞免疫疗法介导的CRS和脑水肿的作用机制仍不太明确，部分原因是因为缺少有说服力的动物模型来探讨重要毒性的发生机制。

通过基因工程完善T细胞基因改造

与TCRs相似，亲和力改变也适用于CAR的设计中，以便增加CART细胞潜在的抗肿瘤能力和调节靶点的非肿瘤毒性。然而，选择最佳的亲和力也是需要反复调整的，例如临床前试验模型表明抗肿瘤活性的改善（但是出现严重的神经毒性）与增强GD2-特异CAR结合力密切相关。

除了亲和力，最重要的还要评价CAR的胞外结构域、跨膜区和信号传导这些能改变CAR功能的影响因素。但不幸的是，几乎没有限定的标准可寻，CAR的设计绝大部分仍然是经验性的。许多案例显示，在非临床试验中不能完全体现出所有的有效性和安全性，这就使得CAR的设计更加复杂化。

通用型CAR T细胞

尽管ACT是从异基因骨髓移植演变而来。但由于MHC所固有的障碍，ACT策略集中于自体T细胞。 如果MHC的屏障清除，那么异体捐献或“通用型”T细胞会较自体T细胞更能发挥更好的疗效。 源自健康供体的通用型CAR T细胞具有克服与肿瘤治疗相关的免疫缺陷的潜力。此外，通用CAR T细胞疗法的使用可能为简化工程细胞制造提供了机会，甚至允许生产“现成”ACT产品。与自体患者特异性T细胞相比，促进更快速和更便宜的治疗。

然而，主要的问题仍然是该方法是否能单用发挥疗效，或仅作为现今确证疗法如干细胞移植或者自体CAR T细胞治疗的桥接作用。

基因编辑和多功能CARs

多种方法均能靶向破坏DNA双链，达到插入或切除突变位点，使靶基因失活的作用。同源直接修复可用于在靶位点插入目标基因。有许多基因编码工具，包括锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALENs、复位内切核酸酶及CRISPR-Cas9核酸酶。这些技术已经成功应用于T细胞工程。现在该领域的主要问题是细菌衍生的Cas9是否具有足够的免疫原性以干扰CRISPR-Cas9编辑的T细胞递送。

人类基因编码给清除免疫抑制提供了机遇，例如能清除CTLA-4和PD-1等的免疫抑制，增强T细胞功能，并可以避免免疫检查点相关的毒性反应。基因编码也被用于清除CAR的靶向基因，可能有利于靶向肿瘤相关抗原，有利于T细胞的肿瘤免疫。

CAR T细胞的商业化

在过去几十年里，肿瘤免疫领域作为一个成功的故事被广泛关注。然而，大多数通常都是非治愈的靶向治疗，能够延长生病和增加癌症患者的生存率。现在有250多项CAR T临床试验正在进行。值得关注的是，这些临床试验存在地域差异，热衷于该研究的区域主要有中国、美国，较少的试验在欧洲、日本和南半球（图4）展开。
图4 CAR T细胞疗法临床试验的地域分布

对于有够有效治疗但不能治愈的血液恶性疾病，特别是慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和多发性骨髓瘤，患者的经济负担在明显增加。美国最常见的白血病CLL，在2000年时大约有10万例患者，由于使用改善但不能治愈的靶向疗法，例如Ibrutinib和Idelalisib，预计美国将增加至约20万例患者。靶向治疗CLL目前不但对个人，而且对整个社会经济都已成为重要的经济负担。现在估计每例患者整个生命周期约花费60万美元，到2025年美国仅CLL治疗整体花费将超过50亿美元。CAR T细胞疗法较现今的标准治疗白血病和淋巴癌的方法花费更高。生产的高度个性化T细胞需要更大的费用，因此迫切期待降低CAR T细胞的生产成本。

未来的机遇和应用

我们值得从多个角度关注治疗白血病和淋巴癌的CAR T细胞疗法，更重要的是CAR T细胞疗法是美国FDA首次批准的商业化基因转染疗法。由于CAR T细胞具有CRS风险和神经毒性，需要随时进行风险评估和处置方案设计，因此FDA要求医师完成不良反应处置的培训。

开发细胞疗法的最大挑战是，由于缺乏非临床试验资料，导致不能有效评估项目的安全性和有效性，不能预见早期临床试验中可能遇到的安全性问题。尽管CAR T细胞疗法对于治疗血液恶性肿瘤的表现良好，但在实体瘤治疗中仍存在许多障碍。

CART研究中的T细胞设计、基因编码和细胞生产都是T细胞疗法潜在的负担。采用T细胞方法作用于其它细胞对于肿瘤免疫以外的其它疾病，如感染、器官移植和自身免疫疾病均有广阔的研发前景。

参考文献

Carl H. June et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science.2018, 359, 1361–1365

来源：药渡   作者：走进心时代