流式细胞术在样本制备环节的具体步骤解析

经常有临床的同学需要用到流式去检测自己的样本，但是却往往不知道从哪里下手，面对各种高大上的理论一头雾水。今天就来帮大家解决“制备流式细胞术样本”这个关键问题。

流式细胞术，简称流式，它的样本制备和染色方法是进行流式分析的基础，它对样本的要求是必须能在鞘液中流动，因此无论是培养的细胞还是从各种组织中取出来的细胞，首先需要做的就是将待测试样本制备成单细胞悬液！黏连细胞的存在会改变细胞群体的真实分布情况，大的团块甚至会堵塞液流系统影响仪器的正常运转，因此单细胞悬液的制备是重中之重！

以人外周血和小鼠脾脏为例，来学习一下单细胞悬液的制备。

外周血

1.取人外周血5mL，肝素抗凝，用等量hanks缓冲液或者RPMI 1640稀释成10mL,混匀；2. 淋巴细胞分离液10mL加入离心管中，轻轻将稀释后的外周血加入到淋巴细胞分离液液面上，保持清晰分层状态。

3.室温下400g离心30min。

注：步骤也可参考所购买的淋巴细胞分离液说明书。特别需要强调的是，离心的过程中上升速度宜慢，离心完后降速阻力一定要为零，不然会将分好层的淋巴细胞分离液打乱，得不到好的分离效果。

4.离心完后可以见到离心管内的血液分为清晰的四层，上层为血浆层，可以取来做ELISA。中间层为分离液层。在上中层界面处有一个以单个核细胞为主的灰白色云雾带，即为淋巴细胞和单核细胞，还包括血小板。底层为红细胞。

5.吸出中间层单个核细胞，如有红细胞污染稍微破红即可。

注：这么做的好处是血浆可拿来做别的实验，如果需要检测的外周血特别少，只有几十微升，可以直接用红细胞裂解液破红，鉴于外周血中红细胞较多，破红时间会比较长。

小鼠脾脏

1.将小鼠脾脏取出，用研磨棒轻轻磨匀（此处可选用5mL注射器的针柄，橡皮头对细胞损伤小），将磨好的细胞悬液过200目的纱布，400g离心5min，弃上清。

2.将将红细胞裂解液加入，弹匀，通常十几秒即可，加大量PBS清洗，离心，弃上清，再拿PBS重悬，即为单个细胞。

注：不同的组织细胞需不同组合酶进行消化。将组织剪碎消化以后进行清洗，离心，过滤，重悬，即为单细胞悬液。同时需要注意有的酶会将细胞的表面标志消化掉，可能影响相关实验结果。因而需要通过不同的方法对自己的结果进行验证。

在制备好单细胞悬液后，我们下一步需要学习的就是如何对已经制备好单细胞悬液的样本进行染色。以免疫细胞为例，一个TEST所需要的细胞量以10的6次方为宜。

1. 先将细胞至于流式管中，300~400g离心5min（为什么不用rpm表示转速是因为每台离心机半径不同，其rpm对应的g都不一样），倒干全部上清（实际上倒不干，约剩25ul左右），轻轻弹匀。

2. 如果是髓系细胞，一定要加入Fc block。因为我们染色用的荧光抗体是IgG，它的结构是酱紫的，Fab段能够特异性识别我们要染的标志，但有一个Fc的尾巴，而髓系细胞高表达Fc受体，所以这个Fc的小尾巴就可能粘到Fc受体上去，造成非特异染色，背景荧光很高很有可能把真实信息掩盖掉。很多说明书上会说这是选择性步骤，如果是不表达Fc受体的细胞，省掉这一步也没关系，但如果不知道是否表达，那还是都加吧。Fc block通常以1:100或者1:200的比例用流式缓冲液稀释，每管加入25ul稀释好的Fc block工作液，混匀，置于冰上孵育10min。

3. 接下来就是配制染色用的抗体工作液了，每管抗体都有一个推荐用量，以一个TEST为例，将一定量的抗体和50uL流式缓冲液混匀，直接加入到已经用Fc block孵育好的样本中（Fc block孵育好之后不用清洗离心），将加好荧光抗体并混匀的样本置于冰上，避光，孵育30min，染色就完成啦。实际上，孵育30min和孵育10min好像没差别，赶时间可以省省。但是对于表达比较弱的抗原，还是应该严格按照protocol来，并且需要比较强弱的分子应该严格保持染色时间一致。

那么问题来了……流式抗体都死贵死贵，按推荐用量三下两下就没了，老板天天黑着一张脸不给买怎么办？在此教大家一个省钱大法（此处应有掌声），实际上几乎所有抗体推荐量基本都是过量的，可以根据你买的品牌以及所染抗原等大胆尝试减量使用，用一半的推荐量，甚至五分之一十分之一的推荐量，观察染色效果有无差别（我反正用过十分之一都没有问题，抗体生产商和抗体销售看到这是不是想揍我）。此外，抗体的染色效果跟绝对量关系相对较小，跟抗体浓度关系较大，因而大家也可以通过缩小染色体积提高单位体积的抗体浓度来减少开支。

4. 染色好之后，加入1mL的流式缓冲液，400g离心5min，弃上清，再加400uL~500uL的流式缓冲液重悬，就可以上机检测啦。此处需要注意的是，不管你前面过滤了多少遍，上机之前一定要拿200目纱布再过滤一遍，尤其是肿瘤细胞或者组织来源的细胞，会形成黏连，千万不要怕麻烦。

5. 如果处理完单细胞悬液，染色完等等时间很晚了来不及上机检测了怎么办？可以在染完色之后用固定液对细胞进行固定，再避光保存就可以了。常用的固定方法有甲醛法和乙醇法。检测细胞表面标志通常用甲醛固定，终浓度为1%。检测DNA通常用乙醇固定，终浓度为70%。目前有很多商业化的固定剂可选，方便快捷。但是！有的染料染完是不能固定的，比如测活性氧的探针及测细胞凋亡的试剂盒等，染完必须检测，请认真阅读所用试剂的说明书。

6. 如果你需要同时检测细胞表面和细胞内的抗原，那么先按上面的步骤染完，再将细胞进行固定、破膜，按上面的步骤把细胞内的抗体加一遍，搞定。固定可能会改变某些抗原表位，因而染胞内抗原之前最好先将表面抗原染完再固定。固定液和破膜液都有商业化的可选，非常方便。需要注意的是染核抗原和胞浆抗原，所需要的破膜液不太一样。为了避免广告嫌疑在此就不具体推荐品牌了。

听上去好像很简单的样子。那么流式缓冲液是个什么玩意儿呢？虽然有商家也卖这个东东，但是鉴于我们比较穷所以都是用PBS代替。实际上，流式缓冲液的成分主要是PBS、BSA以及叠氮化钠。一般来说是PBS加上1%的BSA再加0.05%的叠氮化钠，BSA的存在是为了使细胞保持较好的活性，而叠氮化钠是一种呼吸抑制剂，目的是维持细胞在染色过程中生理状态不发生太大改变。鉴于叠氮化钠是个剧毒物，省掉它对大部分抗原来说影响也不大，所以通常情况下不用也可以。但是，本着严谨科学的态度，你一定要知道这个东东在这里是干什么用的。

处理好之后就需要上机检测了，接下来会教大家如何设门分析自己的样品，如何使用流式细胞术中引用率最高的软件flowjo分析自己的数据，敬请期待！

来源：解螺旋 医生科研助手   作者：罗小黑