Nature：CRISPR基因编辑技术开启五大“门派”

分子学家对CRISPR带来的潜在新技术掀起新一轮探索。

只要出现一篇关于CRISPR-Cas9的报道，Addgene的员工就会立刻找到它。这家非营利公司是论文作者经常储存研究中使用的分子工具的地方，也是其他科学家立即获取这些分子工具的地方，还是一些科学家可以即刻得到相关试剂的地方。“一篇热门论文发表之后，我们几分钟后就会接到电话。”这家美国马萨诸塞州坎布里奇市的公司执行主任Joanne Kamens说。

从2013年年初开始，Addgene公司接到的电话就不断增多。当时研究人员报告称利用CRISPR-Cas9技术，对所选位点人体细胞内的基因组进行了切片。“正是那时发出了召集令。”Kamens说。从那时起，分子生物学家蜂拥着利用这种技术—— 一项可史无前例、轻而易举地用于改变几乎所有器官基因组的技术。Addgene目前已经向83个国家的研究人员发送了6万个与CRISPR相关的分子工具（占其总产品量的17%），2015年，该公司与CRFISPR相关的网页阅览次数超过1万次。

目前，绝大多数关于CRISPR-Cas9的对话都是围绕其治疗疾病或编辑人类胚胎的潜力，但研究人员表示，真正的改革现在正在实验室进行。CRISPR可以提供的以及生物学家所希望的都是“专一性”：在一个基因组的巨大范围内靶向以及研究特定DNA序列的能力。编辑DNA只是该技术的一个可用方面。科学家正在利用这些工具将蛋白精确地传递到DNA目标，以打开或关闭基因，甚至是对整个生物回路进行基因编辑，其长远目标是了解细胞系统和疾病。

“对于分子生物学家来说，这的确是非常强有力地了解基因组如何工作的方法。”马萨诸塞州波士顿儿童医学血液专家Daniel Bauer说。“它的确提升了人们可解决问题的数量。”南加州大学分子生物学家Peggy Farnham补充说，“它蕴涵着无穷的乐趣。”

近日，《自然》撰文介绍了5种CRISPR-Cas9正在改变的生物学家编辑细胞的方法。

打破剪切

CRISPR-Cas9技术有两个主要成分：一个是Cas9酶，可以像一把分子剪刀一样剪切DNA；另一个是小RNA分子，将“剪刀”引向具体的DNA序列并进行剪切。细胞的固有DNA修复机器通常会修复剪切，但是经常会发生错误。

尽管如此，这已经给希望扰乱基因以了解其工作内容的科学家带来了福利。基因编码是无情的：修复中间发生的一个小小错误都会完全改变其编码的蛋白序列，或是完全停止蛋白生产。因此，科学家可以在蛋白或基因扰乱时，研究细胞或有机体发生了什么。

但是还有一种不同的修复通道，有时也会根据DNA模板修复剪切。如果研究人员有了模板，那么他们就能够在选择的几乎任何位点编辑几乎任何想要的基因序列。

加州大学旧金山分校系统生物学家Jonathan Weissman团队希望了解这种基因编辑工具在剪切人类DNA方面究竟表现如何，但他们打算采用一种不同的方法。“我们做的第一件事是：打破剪切。”Weissman说。该团队用“死”Cas9尝试了一些新方法。研究人员将其系在另一个蛋白的一部分上，该蛋白能够激活基因表达。加了几个其他扭曲，他们最终让基因可以根据意愿打开及关闭。

此后，若干实验室基于该方法发表了不同的研究成果。该方法也吸引了麻省理工学院合成生物学家Ron Weiss加入CRISPR的研究热潮。该团队在一次实验中建立了多个基因扭曲，使其可以更快、更简便地构建复杂的生物学回路。“合成生物学最重要的目标是能够通过这些精确的回路构建复杂的行为。”Weiss说。

表观遗传

当遗传学家Marianne Rots开始其职业生涯时，她希望发现新的医疗方法，通过基因疗法靶向那些疾病变异基因。几年后，在荷兰格罗宁根大学医学中心工作的她决定改变行动方向。她认为，控制基因活动的最佳方法是调整表观基因组，而不是基因组本身。

表观基因组是附加在DNA及DNA包裹蛋白化合物（即组蛋白）上的集合体。它们能够控制DNA通路，打开或是关闭通向基因表达的蛋白。而这些标记会随时间改变：随着有机体发育及环境变化，它们会被添加或去除。

过去几年，数百万美元已被投入到这一领域，如计算不同人体细胞中的表观遗传标记以及与大脑活动和肿瘤生长相关联的遗传模式。但是由于没有能力改变具体位点的标记，研究人员就不能决定它们是否会导致生物学变化。

CRISPR-Cas9将会扭转局势。2015年4月，北卡罗莱纳州生物工程师Charles Gersbach和同事发表了一项技术，利用剪切将乙酰基（一种表观遗传标记）添加到组蛋白上。

Rots曾利用相对较老的基因编辑工具锌指酶蛋白探索表观遗传标记的功能，现在她在利用CRISPR-Cas9。“新工具让这一领域变得民主化，而且已经产生了广泛影响。”她说。Rots表示，人们以前经常说，如果重新编写表观遗传基因，并不会对基因表达造成影响，或者两者之间的关系是巧合。“但是现在测试起来非常简单，很多人都在加入这一领域。”她说。

代码解密

DNA表观遗传标记并非唯一等待解开的基因代码。超过98%的人类基因组均未指明蛋白质遗传密码。研究人员认为，大量的DNA发挥着重要作用，所以他们正在利用CRISPR-Cas9了解代码是什么。

RNA分子的一些编码，如小分子RNA和小分子核糖核酸和长非编码RNA，被认为与生产蛋白没有关系，其他序列是在其指令下扩大基因表达的“增强子”。大多数与常见疾病风险相关的DNA序列位于包含非编码RNA及增强子的基因组区域。但是在CRISPR技术之前，研究人员很难了解那些序列在做什么。“我们没有好方法在功能上解释非编码基因组。”Bauer说，“现在，我们的实验精巧多了。”

随着研究人员利用CRISPR-Cas9技术探索越来越多的常规DNA，可能还会出现更多惊喜。然而，即便是利用CRISPR-Cas9，探索这一未知领域也存在挑战。Cas9酶能在RNA向导的指引下剪切需要编辑的地方，但这只能是当一种具体、常见的DNA序列位于剪切点附近时。这会给那些希望让某个基因沉默的科学家带来一点难题，因为关键的序列几乎永远存在于该基因内部。研究人员正在探索细菌王国，寻找能够识别不同序列的Cas9酶的“亲族”。

去年，麻省理工学院和哈佛大学下属博德研究院Feng Zhang实验室发现，一个叫作Cpf1的酶的家族能够扩展序列选择。但是Agami强调，到目前为止所发现的像Cas9一样用途广泛的酶仍然非常少。未来，他希望能够拥有整个系列的、可用于靶向基因组中任何位点的酶。“我们现在还没有到达那里。”他说。

接触光线

Gersbach实验室正在利用基因编辑技术作为理解细胞命运以及如何操纵细胞的部分工具：该团队希望未来有一天能够在培养皿中培育出组织，用于药物检测和细胞疗法。但是CRISPR-Cas9的作用是永久的，Gersbach团队需要不时地打开或关闭基因，并且要在组织中非常具体的位点进行。“模拟血管需要高度的控制力。”他说。

Gersbach和同事选择了不规则的编辑“剪刀”——现在能够激活基因的Cas9，并加入了通过蓝光激活的蛋白。当细胞接触光线后，该系统能够激发基因表达；但没有光后，系统会停止基因表达。由日本东京大学生化学家Moritoshi Sato带领的团队研发了类似的系统，并且也可以在接触到蓝光后激活Cas9，实现基因编辑。

通过将CRISPR技术与化学“开关”相结合，其他人也得到了类似的结果。纽约威尔康乃尔医学院癌症遗传学家Lukas Dow希望在成年大鼠体内产生与癌症变异相关的基因，从而复制出在人类结肠直肠癌患者中发现的基因突变。该团队利用CRISPR-Cas9技术，通过一个剂量的脱氧土霉素激活Cas9，从而使其切断靶向目标。

疾病模型

从癌症到神经退行性疾病等领域的研究人员正在通过CRISPR-Cas9技术创建疾病动物模型。这让研究人员对更多动物、以更复杂的方式、在更大的范围内进行基因编辑。马萨诸塞大学医学院癌症研究专家Wen Xue正在系统地选择肿瘤基因数据，利用CRISPR-Cas9模拟培养皿以及动物体内细胞生长过程中的突变。

研究人员希望通过混合匹配新的CRISPR-Cas9工具，精确操纵动物模型的基因组和表观基因组。“真正的力量是整合那些系统。”Dow说。这可能会让科学家获悉及理解常见疾病的复杂特征。

生物工程师Patrick Hsu在2015年建立其位于加州萨克生物研究所的实验室，旨在利用基因编辑技术在培养皿以及绒猴身上模拟神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症。那样将能够比大鼠模型更有效地重现人体疾病，但是在没有CRISPR-Cas9之前，实现这一切成本极其高昂，且过程极为缓慢。

即便在他设计的实验进行首个CRISPR-Cas9狨猴基因编辑时，Hsu也很清楚，这种方法只是下一种技术的“踏脚石”。“科学技术旧的去了，新的又来了。你不能永远和一种技术‘谈恋爱’。”他说，“你应该永远在思考，什么样的生物学问题尚待解决。”

来源：中国科学报