肝癌免疫治疗的前世今生

2014年的世界癌症报告显示，肝细胞癌（HCC）是已成为男性第五大癌症（每年新发病例约55.4万），女性的第九大癌症（每年新发病例约22.8万）。HCC的高患病率及高病死率（总体病死率0.95），使其成为当前社会主要的健康负担。近日发表于Gut杂志上。

众所周知，大部分肝癌的发病与肝炎相关，因此HCC是研究癌症与炎症关系的理想模型。HCC的主要危险因素包括HBV、HCV、糖尿病、肥胖、酗酒及代谢性疾病等，这些也都与肝纤维化及肝硬化相关。

此外，肿瘤的发展与机体微环境异常相关，这是基于慢性炎症与肿瘤的高发病率相关而得出。而肝脏的慢性炎症是HCC发生和发展的主要危险因素，且肿瘤诱导产生的抗肿瘤免疫对患者预后起着关键作用。

一项合理的假设是，肝脏微环境在炎症的影响下发生重编程，从而与HCC的发病相关。因此，HCC的免疫学研究有助于对癌症进展的免疫学机制进行深入了解，有助于探究新的治疗策略。目前，乙肝疫苗接种已经得到普及，台湾的一项研究表明，疫苗的接种可以有效预防儿童和青少年肝癌的发生。因此，乙肝疫苗可能是第一个可以预防癌症的疫苗。

当前，我们对于HCC免疫学机制的认知主要来源于大部分HCC患者有慢性肝炎病史的流行病学数据、不同实验条件的动物实验以及HCC患者的基因表达分析。而鉴于过去5年中有关肝癌Ⅱ期和Ⅲ期诸多负面的研究，下一步的临床研究将主要依据HCC患者的免疫机制及经FDA批准的新型药物，选择适合患者的替代治疗。

一.HCC患者的自发性消退现象

尽管总体而言很少见，但有文献报道有一部分HCC患者的症状出现自发性消退，其最可能的原因为机体免疫机制和血管事件。最近一项研究显示，两名HCC患者在中断免疫抑制治疗后（因存在不相关的自身免疫性疾病），出现了组织学证实的肿瘤自发性消退。另一项研究表明患有自身免疫性疾病（包括无消化道受累的疾病）的患者，其HCC的患病风险增加。

还有研究证实，HCC患者接受放疗或冷冻治疗后出现了远位效应（及患者体内远位非照射/冷冻的肿瘤发生自发性消退），而有关放疗诱导肿瘤免疫的生物学和免疫学机制，目前仍说法不一。

当前，仅有几项研究证实HCC患者在开展局部消融治疗（包括冷冻治疗和射频消融）、化疗栓塞或其他治疗后，体内存在肿瘤特异性T细胞、自然杀伤（NK）细胞被激活以及诱导产生细胞因子并释放到外周血；而是否能诱导产生肿瘤特异性免疫，尚无系统性和前瞻性研究。

二.肝脏免疫抑制机制

尽管很多证据表明HCC可能对免疫治疗有效，但肝脏并非只有诱导局部抗原耐受的唯一免疫功能。肝脏中包括多种非实质细胞，其中包括人体内最大的巨噬细胞群体（也称Kupffer细胞），其他还有肝树突状细胞亚群，肝窦内皮细胞和肝星状细胞等，这些细胞可通过不同机制来诱导耐受。

生理条件下，这些细胞可阻止细菌降解产物和病原体相关微生物通过门静脉进入肝细胞，从而保护肝细胞。然而在不同的个体中发现了不同的免疫抑制机制，因此对于治疗也可能呈现异质性。

在HCC中证实，有不同的免疫细胞亚群可抑制抗肿瘤免疫。调节性T细胞在肝癌患者体内聚集，并与疾病的预后相关。研究证实这些细胞可被低剂量环磷酰胺攻击，而这一方案也作为免疫联合治疗广泛应用.CD14+HLA-DRlo骨髓源性抑制细胞（MDSCs）是强有力的免疫抑制剂功能的适应性免疫细胞亚群，并积聚在肝癌患者体内。针对这些细胞已尝试了多种化疗方案，同时运用肽-Fc融合蛋白消除这些细胞的特异性方案也得以验证。

另一种清除MDSCs的方法为阻断STAT3通路，进而促进HCC细胞凋亡，且越来越多的证据表明，该方法可能同时针对MDSCs及其他免疫抑制剂细胞。最近一项小鼠实验表明，STAT3通路的阻断可增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤性，且促进NK细胞活化和细胞毒性的相关分子的表达增加。

研究还表明，IL-17也是一种具有抑制功能的重要细胞因子，在肝癌患者的血清和肿瘤细胞中存在。人类CCR4+CCR6+Th17细胞可抑制自身CD8+T细胞反应，IL-17A可促进肝癌生长。IL-6和STAT3对于Th17细胞分化和功能的调控，使得STAT3成为治疗HCC的一个新靶标。一项评估STAT3反义寡核苷酸抑制剂对HCC患者作用的临床试验正在进行。

三.分子层面的免疫研究

一些研究利用全球正常肝脏组织的分子谱来分析与HCC转移和复发相关的分子机制。有研究发现，体液中Th2样细胞因子表达增加形成的抗炎微环境条件与肝癌转移相关，而集落刺激因子1（CSF-1）有可能是在肝脏微环境中高表达的细胞因子之一。Th2特有的结构可以预测肝癌患者术后是否复发，提示非肿瘤来源的结构也可以预测HCC的预后。

此外，预后不良相关的因素包括炎症相关的基因，如干扰素传导、NF-κB活化及肿瘤坏死因子的传导相关基因等。而有关HCC患者肝脏组织内性别及肿瘤相关的microRNA的研究发现，miR-26作为microRNA的一员，与一种肝癌亚型的不良预后相关，且该肝癌亚型对IFN-α辅助治疗比较敏感。目前正在开展一项多中心随机临床试验（NCT01681446），以评估miR-26对IFN-α疗法的诊断性监测。

另有研究表明，预测患者早期（I期和II）生存期的炎症相关基因，包括趋化因子CCL5、CXCL10、CCL2等的表达，与CD8+T细胞、NK细胞和Th1细胞相关。最近发现，一种干扰素刺激基因维甲酸诱导基因-1（RIG-1），在一种肝癌亚型中明显下调，RIG-1的下调与患者的低生存期及IFN-α疗法不敏感相关。

总之，对HCC免疫病理的探讨可能是诊断及治疗的有效途径。

四.HCC标准治疗的免疫副作用

消融治疗可以诱导肿瘤特异性免疫反应，因此可能可作为肝癌免疫治疗的联合疗法。另一项疗法是免疫治疗与索拉菲尼联合。但研究表明，许多细胞毒性试剂以及靶向药物可影响不同的免疫细胞。

已证实索拉菲尼可损害树突状细胞的功能，从而影响对肿瘤特异性T细胞应答的诱导作用。许多研究还观察到索拉菲尼对外周血和肿瘤内CD4+CD25hi调节性T细胞的细胞毒性作用，而免疫抑制性MDSCs的上调也在小鼠试验中被证实。

NK细胞功能受损也被认为与索拉菲尼治疗相关。索拉菲尼可抑制NK细胞的PI3K和ERK磷酸化，进而影响其细胞毒性和IFN-γ的表达。但这些研究的临床相关性仍有待考证。有趣的是，研究显示索拉菲尼治疗的患者，在接种流感疫苗后可产生足够的抗体和细胞免疫反应。

五.HCC动物模型的免疫学研究

目前，多种小鼠肝癌模型被用于研究，其中小鼠皮下肿瘤模型应用最广泛。然而这些模型无法模拟环境因素、肝硬化和慢性炎症对于肝癌的影响。肝原位生长的肿瘤可以通过门静脉、肝内、脾内注射得到。二乙基亚硝胺（DEN）注射小鼠在免疫反应的研究中也应用广泛。

既往有多种肝癌模型来反映不同的疾病状态，如肝纤维化模型、病毒诱导肿瘤模型及非酒精性脂肪肝（NASH）等。近期报道了两种新型的HCC模型，包括长期低胆碱高脂饮食小鼠及普通高脂饮食小鼠模型，它们可诱导产生NASH甚至HCC而不需要癌基因表达或促癌剂的作用。

在另一项研究中，长期低胆碱高脂饮食的小鼠中出现CD8+T细胞、NKT细胞及炎症细胞因子活化，并促使约25%的小鼠在一年内发展为NASH甚至HCC。

尽管有关HCC患者开展标准免疫疗法的研究结果差强人意，但最近四年仍开展了大量的临床前研究，并提供了针对肝癌的一些新思路。

甲胎蛋白（AFP）疫苗已被证明可启动AFP相关免疫反应，并损害DEN相关肿瘤的生长。尽管针对单一抗原的疫苗的应用价值有待讨论，但该疫苗对于肝硬化晚期及存在HCC风险的患者可能为一个很有价值的预防途径。

还有研究表明，使用抗CD137单一抗体的肝原位癌小鼠，有60%左右可产生肿瘤消退。而抗PD-L1抗体、抗CD137和抗-Ox40抗体三联免疫治疗，对于c-myc转基因小鼠的自发性肝癌有显著的疗效。

研究对于不同状态下的聚乳酸-乙醇酸微球进行分析，后者是借助李斯特菌单核细胞基因载体进行免疫接种而产生，结果显示其可诱导有效的抗肿瘤免疫，使得肿瘤完全缓解并延长了小鼠的生存期。

另一项研究表明，IL-5治疗后可使DEN小鼠的肿瘤体积缩小80-100倍，同时检测到嵌合抗原受体的T细胞，进而诱导抗肿瘤免疫。由于该方法是在早期研究患者的治疗，许多障碍还需要克服，如发现准确的抗原、正确的信号域及合适的患者群体。

最后，所谓“人源化的小鼠模型”，指的是将人肿瘤细胞注射到免疫缺陷小鼠（RAG2−/−γC−/−）中，也在HCC的免疫研究中得到了应用。在该模型中，人类同种自杀基因修饰的杀伤细胞被证明具有类似于NK、NKT细胞的功能，并显示出对原位模型的抗肿瘤活性。

六.增强抗肿瘤免疫途径

目前为止免疫位点抑制剂是增强抗肿瘤免疫最成熟的分子，三种不同位点抑制剂已被FDA批准用于治疗黑色素瘤患者，分别为ipilimumab（抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，anti-CTLA4），pembrolizumab（抗细胞程序性死亡蛋白1，anti-PD1）和nivolumab（anti-PD1），其他试剂还处于临床研究阶段。这些药物在黑色素瘤及非小细胞肺癌（NSCLC）患者中已取得显著疗效。

研究表明，具有体细胞高突变率的癌症对于免疫位点抑制剂的反应最好，研究报道在HCC中存在50个非同义突变，而黑色素瘤有75个，NSCLC有130个。然而应该注意的是，肾细胞癌对于抗PD1治疗也有显著疗效，尽管其体细胞突变率较低。

最近一项临床研究报道了20例HCC患者应用tremelimumab(anti-CTLA4)的安全性、免疫反应及临床活动的早期指征等。目前正在开展有关该药物与消融的联合治疗疗效的临床研究。

CD40是广泛表达与多种免疫细胞的刺激分子，通过单独或联合作用刺激CD40来增强抗肿瘤免疫也是另一个正在研究的方法。在啮齿类动物肝癌模型中，腺病毒介导的CD40
L基因通过诱导体液和细胞免疫来抵抗HCC，以及CD40L表达的树突状细胞可诱导小鼠体内肿瘤的消退。

七.肝脏直接免疫途径

肝脏可以被多种病毒感染，因此，以病毒为载体将效应分子直接作用于肝脏肿瘤细胞的疗法也很理想。在肝癌模型中已尝试了不同的载体，如腺病毒，牛痘病毒等，其中溶瘤病毒疗法在临床前研究中效果显著。该疗法可激活固有免疫，并延长适应性免疫。

肝癌特异性靶向可以采用α甲胎蛋白启动子联合一个缺氧反应元件，后者在肿瘤微环境中表达下调。JX-594是一种溶瘤治疗的病毒，即牛痘病毒表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。该病毒的瘤内注射已在肝癌患者中证明了可行性、安全性及疗效的早期信号。然而，在一项随机的2b期临床试验中，并没有显示出其可以提高一线化疗失败的晚期HCC患者生存期。

八.肝癌标准疗法联合免疫治疗的临床试验

HCC免疫疗法联合标准治疗是一个有趣的选择，许多研究已开始验证这一疗法。已有研究开展经导管肝动脉栓塞（TACE）结合瘤内树突状细胞注射治疗，且患者的初步结果证明了该疗法的安全性。另一项研究也证实了联合治疗的安全性和免疫活动标志，该研究通过化脓性链球菌冻干剂刺激机体产生树突状细胞，同时联合TACE开展。

三项研究分别报道了不同的消融治疗（如冷冻，微波或射频消融）联合适应性免疫治疗（通过NK细胞、γδT细胞及细胞因子诱导杀伤细胞）。适应性细胞免疫也在研究中进行了检测，然而目前缺少随机对照试验数据。总之，大部分的研究均缺乏对照试验，因此他们的结果是非常有限的。此外，免疫检测相关的数据也是有限的。

总结及展望

我们应该认识到，并非所有的肿瘤对于免疫治疗都有相同的易感性。尽管抗CTLA-4和抗-PD1 / PDL1疗法在黑色素瘤和其他一些肿瘤（如肺，肾癌等）效果显著，但是大多数胃肠道肿瘤患者对于免疫抑制疗法并没有显著效果。帮助我们更好了解这些差异的研究仍在开展。

世界上许多研究室已成功确定的具有独特的肿瘤生物学标志的HCC亚类。此外，这些研究结果表明了相关免疫机制负与患者预后的相关性，有助于将来依据患者类型选择不同的免疫治疗，而这对于临床治疗意义重大。

HCC的消融治疗应用广泛，因此其与免疫治疗的联合治疗较为理想。以往有观点认为以化疗为一线治疗的患者不适用于免疫治疗，但目前有关肺癌及胰腺癌的一些研究数据得出了相反的结论。

最后，这些早期临床实验对于我们起到了重要的提示作用，今后的研究中通过对受试对象的肿瘤和外周血中进行完善的免疫监视，采用准确的监测方法来检测肿瘤的反应，选择最佳的小鼠模型模拟患者的临床终点，最终将完成一项成功的临床研究，进而为改善HCC患者的预后做出应有的贡献。

来源：丁香园