一文读懂新型冠状病毒的核酸检测_医疗器械

2020

02/07

15:10

中国器审医疗器械

2019年12月以来，武汉市部分医疗机构陆续出现不明原因肺炎病例。国家药品监督管理局随即启动《医疗器械应急审批程序》。目前，已批准7家企业的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒上市。为进一步合理使用上述产品，有效满足疫情防控需求，现将使用情况做如下说明：

新型冠状病毒的核酸检测原理

所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），新型冠状病毒是一种仅含有RNA的病毒，病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其它病原体的标志物。新型冠状病毒出现后，我国科学家在极短的时间里完成了对新型冠状病毒全基因组序列的解析，并通过与其它物种的基因组序列对比，发现了新型冠状病毒中的特异核酸序列。临床实验室检测过程中，如果能在患者样本中检测到新型冠状病毒的特异核酸序列，应提示该患者可能被新型冠状病毒感染。

检测新型冠状病毒特异序列的方法最常见的是荧光定量PCR（聚合酶链式反应）。因PCR反应模板仅为DNA，因此在进行PCR反应前，应将新型冠状病毒核酸（RNA）逆转录为DNA。在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；如反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高， Ct值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。

新型冠状病毒的核酸检测流程

对于新型冠状病毒的核酸检测，首先根据试剂盒说明书【样本要求】部分进行样本采集，常规的样本类型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。由于新型冠状病毒为RNA病毒，RNA易降解，因此，采集样本时使用无RNA酶的拭子和无RNA酶的储存管。获得患者样本后，需尽快进行检测，如无法立即检测需要转运的样本，应按照说明书的要求进行低温封装，并送到专门的检测机构进行检测。检测机构收到样本后，对样本进行核酸提取，核酸提取试剂应使用批准产品说明书中指定的核酸提取试剂盒。

（图：咽拭子取样示意图）

病毒RNA需要首先逆转录为cDNA，再进行扩增检测。PCR扩增和检测应使用批准产品说明书中指定的荧光定量PCR仪，通过荧光定量PCR所得到的样本Ct值的大小，可以判断患者样本中是否含有新型冠状病毒。

上述过程中样本的采集、保存、转运，样本核酸的提取和检测、结果的判读均须严格按照试剂盒说明书要求进行。欲直观了解具体的检测过程，可查询相关示范视频，例如北京协和医院录制的示范短片。（各企业的提取处理等过程不尽相同，该视频仅为举例，具体操作应参照产品说明书）

使用新型冠状病毒核酸检测试剂盒的注意事项

（一）全流程的质量控制

在新型冠状病毒的检测过程中，三个最为关键的要素是人员，实验室和试剂盒。

首先，核酸检测的整个检测流程操作复杂，不同产品因存在不同反应体系及适用机型等因素，操作过程中试验人员应按照各自产品说明书要求进行。

实验室检测往往从样本提取开始，但实际上，要保证样本的检测准确，应从患者样本的采集开始进行质量控制，并对后续各个流程规范操作（如样本的保存、转运等）。有研究表明，不同人员对同一患者的样本进行采集，可能存在不同的检测结果。试剂在保存、运输及使用过程中操作不当均可能影响其检测结果。因此，需要严格按照说明书的规定操作。

其次，新型冠状病毒传播能力强，危险系数高，个人防护应为生物安全三级实验室级别。每个操作人员必须具备专业技能且拥有PCR检验资质。整个操作过程中需防范气溶胶污染对人员的感染风险，并做到准确加样和正确使用试剂和耗材。

最后，为防止病毒扩散，检测新型冠状病毒的实验室必须达到生物安全二级（P2）及以上实验室条件，实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验操作必须严格分区，各区域使用的仪器、设备、耗材和工作服必须专用，不得交叉使用，避免污染。

所有检测样本应视为具有传染性物质，实验过程中穿工作服，戴一次性手套并经常替换手套以避免样本间的交叉污染；样本操作、废弃物处理均需符合卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》等相关法规要求。

（二）检测结果判断要求

目前批准产品均基于新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）进行选择。不同产品的检测原理基本一致，但是其引物、探针设计存在不同，有单靶区段（ORF1ab）、双靶区段（ORF1ab、N蛋白）、三靶区段（ORF1ab、N蛋白和E蛋白）的检测和判读差别。建议使用者应严格按照不同企业说明书规定的判读方式进行判读。

依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》确诊病例要求，临床诊断病例或疑似病例，具备以下病原学证据之一者：1.呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸为阳性；2.呼吸道标本或血液标本病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。

如临床人员对检测结果感觉明显不符。建议对整个检测环节（如：对样本的采集、转动及处理等环节）进行分析。应关注检测结果为阴性的患者，不排除新型冠状病毒早期感染或其他呼吸道病毒感染等。如条件允许，建议采集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的样本进行复测。

来源：中国器审

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