CRISPR女王最新发现：一种抗CRISPR蛋白能减少脱靶效应

去年12月，两组科学家发表了几种可以阻断CRISPR-Cas9活性蛋白质的重要发现，而7月12日，研究人员又再次指出，利用其中的一种抗CRISPR蛋白能减少Cas9介导的人类细胞基因组编辑中的脱靶效应。

这一研究成果公布在Science Advances杂志上，由美国加州大学伯克利分校Jennifer Doudna教授，以及Jacob Corn等人领导完成。

Corn表示，“CRISPRs是细菌免疫系统的组成部分，对于生物学来说一个基本的概念就是如果某种生物开发出了一种武器，那么它也会同时准备好一种防御手段。事实证明。 。 。噬菌体已经进化出了关闭CRISPR系统的方式，就是这些抗CRISPR蛋白。”

去年年底，Corn与加州大学旧金山分校的Joseph Bondy-Demony等人共同发现了几种存在于李斯特菌中的抗CRISPR蛋白，其中两种蛋白抑制剂AcrIIA2和AcrIIA4阻断来自酿脓链球菌的Cas9酶活性，Cas9是一种经常用于基因组编辑中的DNA切割酶。

在此基础上，为了深入探索AcrIIA4的作用机制，研究人员采用了多种方法，如冷冻电子显微镜和人体细胞培养等方法，发现这种抗CRISPR蛋白是通过竞争绑定到通常是用来结合DNA的Cas9酶上“凹陷袋”结构域来发挥作用的，这样能阻断Cas9酶与DNA的相互作用。

这次首次针对天然蛋白抑制剂AcrIIA4如何与Cas9酶相互作用的研究，研究人员发现AcrIIA4会与“凹陷袋”内的酶结合，AcrIIA4与酶的结合可阻止Cas9酶附着于靶标DNA并对其进行切割。对人类细胞的研究揭示，如果这些细胞在基因编辑开始前就用这一蛋白抑制剂进行处理，那么CRIPSR-Cas复合物就可大体上被阻止对任何部位的DNA进行剪切。

结果还显示，大约一半的CRISPR-Cas9对DNA的击中目标的编辑（即该系统按照科学家所希望的方式对基因编辑进行正确的剪切）发生在这一系统进入后的6小时内。之前的研究显示CRISPR-Cas9可能在偏离靶标部位留置一段时间，但未对它们进行剪切。通过利用这一时间差，研究人员在人类白血病细胞内引进了一个被指示对2个基因（其中包括与镰状细胞病有关的基因）进行剪切的CRISPR-Cas9复合物，并接着在6小时后添加了AcrIIA4。结果显示，在恰当的时间添加AcrIIA4可防止在错误的位置剪切基因，同时CRISPR也仍有时间在正确的位置进行基因剪切。

这项研究指出了AcrIIA4的作用机制，提示了一种新的调控哺乳动物细胞基因编辑的方法。最重要的是在引入CRISPR-Cas9数小时后将AcrIIA4添加到人类白血病细胞中，在不影响CRISPR正确剪切的同时，可减少CRISPR-Cas9的脱靶效应，

“虽然这一研究工作和发现令人印象深刻，而且十分重要，但并不是十分出乎我们的意料。因为这对于抗CRISPR蛋白作用来说非常合乎逻辑。这种机制。。。以前在其他系统中就曾经有过，之前的研究也发现过通过噬菌体核酸酶抑制剂蛋白的DNA模拟。”麻省大学Erik Sontheimer教授说，Sontheimer教授虽然没有参与这项研究，但他是Intellia Therapeutics的共同创始人（另外一位创始人就是Jennifer Doudna），目前这一公司正在利用天然蛋白抑制剂（并非AcrIIA4）进行研发。

来自多伦多大学的分子遗传学家Alan Davidson（未参与这项工作）表示，近期Nature杂志，Molecular Cell杂志都发表了类似的成果，Davidson与Sontheime等人一起申请了另外三种抗CRISPR化合物的专利。“这些都有基本相同的结构，相同的蛋白，以及类似的结论。我认为这篇最新论文唯一的差异就是一些关于基因组编辑的数据，即基因编辑时抗CRISPR能减少少脱靶效应。”

这是一个非常有竞争力的领域，从各方面的论文来看，这一领域发展的非常快。

Corn表示，这些抗CRISPR蛋白不仅可以用于遗传学研究，而且也可以作为临床工具。它们不仅有助于减少脱靶效应，还可以成为控制打靶的有效途径，比如一些基因治疗方法也许会在患者细胞内残留下活性Cas9，这需要被关闭，“基因编辑的开关非常关键，但关闭开关也是同样重要的。”

不过目前还需要进行更多效应和安全性研究，科学家们需要了解这些抗CRISPR蛋白的人类免疫反应是什么，因为它们来自细菌病毒。“我们只是进行单纯的抗CRISPR蛋白研究，没有人知道是否还有其它的工具在等着我们。”

参考资料

Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic

来源：生物通   作者：张迪