比昂生物杨光华演讲实录：基因与细胞治疗的前沿发展

我今天跟大家分享主要是基因细胞领域，整个在干细胞治疗领域的一些概括。我就具体的参与过的几个项目和大家一起分享一下。

第一张幻灯是我个人的简介，在西班牙工作，然后读书，回来之后在浙江理工大学工作过一段时间，在法国一直做研究，11年的时候入选了千人计划，目前在同济大学担任东方医院的临床医学转化中心的免疫疗法治疗室的负责人。因为只有半个小时，我要把幻灯缩短一下。主要介绍：一是基因治疗载体，谈到基因与细胞治疗，离不开就是载体，原理是什么；二是基因治疗目前在国际上应用在哪些方面，主要是联合干细胞做了一些工作，第一个方面是艾滋病，第二个是干细胞，干细胞目前用基因载体去修饰的项目也有，我参加的FB7，还有CAR-T的一些应用；最后重点介绍一下肌母细胞，实际上我们忽略了国际上非常熟悉的细胞，本来今天罗教授要参加会议，但他目前在加拿大，所以今天我就把罗教授这块的研究跟大家分享一下。

一、基因治疗载体

这是简单的基因与细胞的概括，首先人体的一些疾病跟基因的突变相关，怎么样把基因进行修饰，然后进行改造，再跟我们人体内产生病变的细胞进行修饰，最后回到体内，发生相关损失掉的功能，作为基因与细胞联合治疗的方式。

基因治疗这个方面的载体可以分类，一方面是病毒的载体，另一方面是非病毒的载体，病毒类的有很多，腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒等等，我今天重点讲的是其中一种病毒，叫慢病毒，来自HIV-1修饰过来的，所以刚才CART治疗白血病就是用了慢病毒载体，那么它的优势在哪里，后面会慢慢介绍。我们中国有第一个基因治疗的腺病毒的药，治疗癌症的癌症P503，就是用的腺病毒。另外还有一类非病毒载体，和病毒性载体相比，它的安全性可以保证。它可以规模化生产，也可以标准化生产，所以它临床应用也很广泛。

慢病毒载体来源于HIV-1，通过基因组进行修饰，进行改造，科学家做了很多的工作，从94年开始第一篇文章等等，从第一代的慢病毒到第四代慢病毒，第一代是把HIV-1里面的相关的、不必要的一些蛋白质，一些调节元件剥离开，所以做了很多安全性研究，最后做成我们需要的病毒类载体，为什么临床要用它？是因为它安全上已经过了，说明它自身的病毒类蛋白已经过掉了，目前需要的是它把外面的目的基因带到基因里去的功能。

这个就简单描述一下。因为它是一个RNA病毒，进入细胞之后进行里逆转录，逆转录成了CDNA，然后CDNA进行整合，把外源的基因整合到细胞里面，才把基因通过稳定的细胞进行表达，这是慢病毒的一个优势。

这是用慢病毒进行表达GFP，做了很多原代细胞等等细胞的转导，转导之后它的表达力和感染力非常高，转载优越于其他一般的病毒载体。

这是我们前期用慢病毒载体转染的一些DC细胞，后面还有T细胞、C细胞等。这里就不赘述了，后面朱泽教授会进行阐述。

二、基因治疗在国际上的应用

在艾滋病基因治疗方面的应用，96年开始了临床实验，用第一代慢病毒载体修饰T细胞，CD-4阳性的T细胞，把慢病毒表达了一段反ERNA干扰艾滋病毒的基因组，当时临床很轰动，现在已经进行到临床三期了，就是用了慢病毒载体表达了反ERNA。

通过后期的科学研究发现，有几篇在杂志上发表，艾滋病不仅感染CD4的阳性细胞，同时它在病人体内的造血干细胞也有潜伏，所以在CD4阳性T细胞进行修饰之后，不能彻底清除这个病毒，因为它本身在造血干细胞有残留。后来就有几个小组做了下列的设计，将病人部分造血干细胞取出，再通过慢病毒载体的修饰，从事CDR-5的干扰，把受体干扰掉，另外它表达的SHRNA，去干扰病毒载体必须要的一些结构蛋白，这样的话同时把这个细胞进行保护，因为CDR-5是HIV病毒感染T细胞时候的一个受体，受体干扰之后，有研究表示它大大降低干扰T细胞的能力。

所以，做了两方面的工作，一方面保护细胞不被感染，另一方面保护细胞内持续表达RNA将这个病毒的基因组破坏。

在临床治疗方面采取了首先病人的造血干细胞或者在体内获得，在体外通过基因药物载体通过修饰移植体内，这是一个治疗方案。后续我们和美国在体外进行了一些实验，发现我们用刚才的载体设计的效果，比现在在它现在VER469效果好，下面我们在中国这边会联合疾控和广州八院、中山大学的研究所在艾滋病方面进行临床方面的工作。

三、基因治疗载体在干细胞治疗中的应用

下面讲基因治疗载体，在分化过程中怎么把外原基因携带基因持续的表达，需要慢病毒进行修饰，目前在临床上很少用慢病毒直接修饰干细胞做临床，一个问题就是它的安全性，因为它整合到染色体里面，整合的部位在哪里，方位是不是安全，这些都是一个范围。慢病毒载体在干细胞方面，我们怎么用，首先第一个把慢病毒载体做了非整合的慢病毒载体，就去掉了刚才的一个问题，留下了它高效的转导效率的特性，去掉了它的不安全因素和整合因素，这个载体整个项目中，首先讲到的就是在体外，欧盟这个大框架项目是七个国家一起参与，我主要负责的是胚胎干细胞HIC，在体外进行定向分化。

大家知道中国肝病很多，肝移植很多，但解决方案很少，我们就在体内制备成熟的肝脏细胞，成熟的肝脏细胞以前是死刑犯或者其他的肝组织里进行提取，然后进行移植。现在我们仅仅做的是研究，我们用的是胚胎干细胞，另外一个小组和剑桥合作做APS的合作。这个分化完的细胞不纯，我们做下来，胚胎干细胞经过16年的分化大概可以获得85%的肝组细胞，我们怎么样把这部分细胞提纯，如果不提纯的话，用于临床是非常困难的，剩下的是什么细胞呢？有纤维细胞和神经细胞。有一次很有意思，分化完了之后，有一天早上我去看细胞，还没有通过显微镜看的时候，我的培养细胞在抖，当时觉得桌子在抖，后来就拿显微镜一看，发现细胞在跳动，这就是细胞分化过程中的不同细胞，所以我们临床不会直接拿来用，进行了纯化，这个工作就进行了基因载体进行了纯化。用肝组细胞表达了绿色荧光蛋白，这样转导细胞之后三天之后会产生绿光，就是我需要的细胞，不产生的绿光就不是，所以通过把绿色荧光分解，发现整合效果非常好，分离出的慢病毒载体可以达到我们的疗效，细胞可以分离出来，它也没有整合，后续做了一些标志物的检测，去年刚刚发在两篇国际杂志上。

四、基因治疗载体在肿瘤免疫细胞中的应用

下面讲一下在肿瘤免疫细胞中的应用，主要讲的是CAR-T，刚才郑教授也讲了，后面还有两位教授会讲CAR-T，CAR-T目前在临床上治疗白血病已经得到非常确切的疗效，那么CAR-T的靶点怎么寻找和制作。免疫细胞不说了，国家已经颁发了第三类医疗技术，如果要做可以通过第三类医疗技术报备的方式。这有相关的一些文件。这是刚才介绍过诺贝尔奖11年颁给了DCA细胞。

讲一下靶向性细胞治疗。在介绍之前，我介绍一下CTL细胞。目前在国内做的比较是DCCIK，目前是第二代或者第三代的治疗比较多。第四代靶向的免疫细胞治疗，我们通过DK在体外培养得到了CTL细胞，进行监测和培养，我们不仅有这个技术可以治疗癌症，因为我们抗原可以选择，所以现在我们在和309医院针对肺结核、结核杆菌的研究进行导向性和靶点的选择，另外针对乙肝和其他的疾病都可以通过这个技术可以达到临床的实验。

我们在巴黎的时候做了一例临床实验，是非细胞肺炎，直接用裸基因的表达框是一种方案，另外是朱教授介绍的是信使RNA表达，然后做重化，然后再抗原的负载。CAR-T重要的一个产业化环节是什么地方？就是在基因载体生产，合不合格直接影响CAR-T的临床应用。在中国生产GAP级别的基因载体，所以我们06年一直在完善，准备大规模的生产设备和生产，去年我们看到这场设备，在慢病CAR-T方面突破性的进展，那时候我就看好这个载体，想不到在去年是这么大的爆发，目前在这个上临床上需求量非常大，所以我们要做好，在临床上，医院想使用，我们可以提供，大规模的生产GAP的产品。

朱教授一会儿会和大家详细介绍RNA，因为我们一直在合作，在天津医科大学做RNA的实验。

五、肌母细胞细胞治疗

什么是肌母细胞，包括我们国家引进肌母细胞要怎么做。肌母细胞是罗教授在美国研究了四十年，后来到加拿大，中国通过外交部和使馆一系列的工作，罗教授11年已经回国了，也入选了千人计划，罗教授是68岁唯一破格录取的。

肌母细胞移植研究，包括肌肉萎缩，一个细胞怎么会有如此强大的功能？整个发表，包括《柳叶刀》、《科学》《自然》等等，肌母细胞的原创专利，还有一些已经发展的项目。

心脏病三期，肌萎缩三期，二型糖尿病是一期，癌症二期，中国医师学会去年开了论证会，这个技术全部引进回国，把肌母细胞作为项目转化。首先它对心脏病进行治疗，在美国是受治疗，还有肌肉萎缩，可以根治营养不良的肌肉萎缩，在二型糖尿病有很大的需求。目前是20个国家一起参与的临床中心，280个肌萎缩和300个心脏病病人，是非常安全。FDA批准了19项肌母细胞治疗临床实验，多为二期、三期的心脏病治疗。这是13年2月28号的专家论证会，为什么要论证肌母细胞呢？因为我们国家把干细胞已经列为药品管理，作为临床的管理规范，肌母细胞是不是，如果是该怎么做，如果不是该怎么做，所以中国政府一定要通过专家委员会论证，首先论证肌母细胞不是干细胞，它不是最上游的干细胞，所以把它列在第三得细胞的管理范畴里面，是卫计委这边主管，它知发展成肌肉。

肌母细胞是已分化的最原始肌性细胞，能天然融合形成肌管，产生收缩蛋白，令肌细胞再生，增强骨骼肌和心肌收缩功能。心肌营养不良导致心肌细胞坏死，需要新的肌肉生长，所以首先在人的大腿上提取两颗肌肉，进行细胞提取，后面会讲到临床上怎么做的。这里有一些幻灯片，因为和俄罗斯政府的一些心脏病专家做了很多的临床。

这是整个细胞的整个过程，采取、培养，大规模的扩增。这个实验室国家投资了一部分，投资公司投了一部分，肌母细胞的GMP生产车间。肌母细胞的量在量上进行了验证，一期、二期、三期，最后是800万个细胞，在全省82个和197个病人，反应非常好。这是罗教授第一次发表了这篇文章是细胞移植，这是目前能查到细胞治疗的基础上90年发表的，第二篇是美国细胞治疗之父发表的，所以很多细胞标准制定都是参照罗教授的文章写的。

这个图，左边腿是抬不起来的，现在能够自由的伸曲，而且这是第一个在轮椅上4年多，经过移植之后站起来的病人，因为心肌萎缩、呼吸功能也都萎缩，通过治疗之后，病人呼吸功能和有效性全部改善。这是DMD的病人，这些病人到目前还活着，临床上所有医生都知道DMD病人活不长的，这些病人都活着，每年会有一次聚会，到加拿大和罗教授一块儿参加肌萎缩病人的聚会。

这是三期的实验结果，产生肌母细胞增强蛋白，另外增加了70%的肌纤维的改善，18个月肌力平均增加了123%，9个月呼吸改善19%，75%的临床实验者病情改善，延长病人的寿命。这是15年期间治疗的280个病人的两年回访，没有死亡和昏迷，没有心脏肾肺的损伤。

急性心梗的细胞繁殖能力有限，因为目前治疗干细胞，怎么纯化在体外获得的干细胞，没有干细胞非常重要，令肌母细胞再生地增加心肌收缩功能。这是俄罗斯国家心脏病中心，做的肌母细胞的移植术，通过导管的接入，3D的模型脑干细胞注射。

300例的心脏病临床实验的结论，改善左心室射血赠送，唤起生存能力，舒展压等等，还有6分钟步行的距离，使心脏再生，这个技术被五个国家允许收费，用肌母细胞治疗一个心脏病人是5万美金，在我们国家目前正在要进入的有安贞、辅外、武警总医院、海军总医院，上海有瑞金、中山、还有广州机甲医院也都在参与细胞治疗心脏病。

这个肌萎缩是单基因缺陷，二型糖尿病是GLUT4和IRAP的双基因组缺陷，为什么能够治疗呢？就是因为它是好的供体的肌母细胞，表达正常的肌母细胞表达到干细胞上，这样就可以完成这些细胞表达的蛋白功能。所以它对二型糖尿病是非常有帮助的。

最后还有两张幻灯，肌母细胞可以杀死肿瘤细胞，第一个是肌母细胞达到肿瘤细胞当中，肌母细胞自己发生融合，融合的时候会产生破裂，释放出250倍的TNF，这个是在东方医院，因为要上临床，所以需要有一些实验，在以色列已经做到临床二期了。因为今天幻灯片很多，会后可以做一些详细的了解，我们还有一些临床和临床数据，一会儿朱教授也会和大家分享，有哪些医院可以一块儿合作开展等等。我就讲这么多，谢谢！

来源：Bio4P