《Nature Biotechnology》公布合成DNA新方法

自20世纪70年代起，研究人员就已经开始进行合成DNA的研究。合成DNA对于药物、燃料及其他化学用品的研发具有重要意义。随着一些从事生物医药、工业酶、或有用的化学物质生产的商业公司对订制基因的需求，DNA合成这一课题变得越来越受人关注。除了商业应用，研究人员也需购买合成基因并将它们植入到动物或植物的体内，又或是用来尝试基于CRISPR的新的疾病治疗方式。

传统的DNA合成方法是将DNA的核苷酸（化学字母A、G、C、T）逐一添加，形成一个被称为寡核苷酸的链。但这一方法被局限于只能直接产生长约200个碱基的寡核苷酸，因为随着长度的增加，合成过程中会出现不可避免的错误，导致正确序列的产量很低；同时，这一过程成本高昂且非常缓慢，还会用到一系列有毒的有机试剂。如过科学家想要用这种方法合成一个小基因（通常由数千个核苷酸构成），那么必须对它们进行逐段合成，每段长度约为200个碱基，然后再将它们缝合在一起。这非常耗时，而且具有较高的失败率。

最近，加州伯克利分校和劳伦斯伯克利国家实验室的科学家发明了一种合成DNA的新方法，它可以更简单、更快速、并有潜力更精确的进行DNA合成，而且无需使用有毒的化学物质。这一技术的高准确性，让它可以产生10倍长于现有方法产生的DNA链。这次对DNA合成问题的研究就是由博士生Sebastian Palluk与研究生Daniel Arlow一同完成的。在6月18日的《自然-生物技术》杂志上，他们详细介绍了这一新技术的相关细节。

新的技术依赖于在免疫系统的细胞中发现的一种DNA合成酶，这种酶在水中自然地拥有将核苷酸添加到DNA分子上的能力（DNA在水中最稳定）。该技术有望提高精确度，从而让合成的DNA链含有数千个碱基，长度增加到过去的10倍，成为中等尺寸基因的大小。

细胞合成DNA的方式与现有技术是完全不同的。它们拥有一类被称为聚合酶的酶，可以读取单链DNA，然后合成一条能与其结合的互补链。这一特征让许多科学家一直梦想能通过重新设计聚合酶来编写新的DNA。在20世纪60年代，科学家发现了一种不寻常的聚合酶，它可以在不遵循已有的DNA模板链的情况下，将新的核苷酸附加到寡核苷酸链上，这种酶被称为TdT（末端脱氧核苷酰转移酶）。

天然的TdT这样做是为了编写数百万个抗体基因的新变种，免疫系统可以选择这些变种来攻击入侵者。它具有非常高的合成速度，在自然状况下，它能每分钟将DNA扩展约200个碱基。但天然的酶添加新碱基的过程是随机的，而不是研究人员想要的能精准控制的碱基顺序。

多年来，许多实验室都试图利用这种酶来合成所需的DNA序列，但这种酶很难控制。关键的问题在于如何让酶在添加一个核苷酸后停止，然后再用不同的核苷酸来重复这个过程。在以前的所有提议中，科学家都试图在DNA的四个碱基中添加化学基团来作为“终止”信号。因此，当TdT向任何长度的寡核苷酸添加修饰过的某一种碱基时，就能阻碍另一种碱基的添加。然后，他们再对此时的寡核苷酸进行清洗，接着用另一种化合物进行处理，以备下一次延伸。

但是，TdT与这些被修饰过的核苷酸并不能很好地配合。它非常“挑剔”，例如在这样一个这系统中，每添加一个修改过的碱基需要大约一个小时，这非常耗时，很难被大规模的运用。

在新的方法中，两个年轻的学生用一种新颖的方式将问题解决了。他们从4个分开的碱基池开始，每一个里面都有被“栓”到或A、或G、或C、或T上的TdT。为了让寡核苷酸增长，他们向其中一个池中添加一种碱基。当TdT将碱基添加到寡核苷酸的末端之后，它仍维持栓系状态，这就有效地阻止了任何额外的酶复制物与寡核苷酸反应、以及导致进一步的延伸。这时再将寡核苷酸捞出，剪断栓系，游离的TdT会被清洗掉，而寡核甘酸也做好了添加下一个碱基的准备。

这种方法成本并不高，因为TdT很容易在细菌和酵母中生产。同时，它也非常快。据此次研究称，大多数新的核苷酸会在10到20秒之内附着于生长中的寡核苷酸。但是，剪断栓系的步骤仍需要一分钟左右。因此合成一个完整的基因仍可能需要耗费大半天的时间。

在首次尝试中，他们在10个循环中使用工程化的TdT酶产生了10个碱基的寡核苷酸。新方法的出现并不代表将完全废除传统的DNA合成方式。在他们对“产品”进行分析时，发现大约80％的DNA分子具有了预期的10个碱基序列。这意味着，每个步骤的平均精确度为98％，低于传统方法的99％。但这对于一个已经持续50多年的难题来说已经是非常好的结果了。

若要用这一方法编写长达1000个碱基的寡核苷酸，则需要99.9％的单个准确度。而这也正是研究人员的目标。如果真的达到这样的准确度，那么它将不仅能彻底改变合成生物学中对新基因的编写和测试，而且还能在DNA中编写大量的数据库。

通过直接合成长链的DNA分子，能大大减少将寡核苷酸拼接在一起的必要性以及由此产生的繁琐过程。这样的话，在几天之内直接合成出研究人员需要的基因长度的序列，将不再是遥不可及的事。

参考来源：

http://news.berkeley.edu/2018/06/18/new-dna-synthesis-technique-promises-rapid-high-fidelity-dna-printing/

http://www.sciencemag.org/news/2018/06/new-technique-could-help-scientists-create-gene-just-1-day

https://www.nature.com/articles/nbt.4173

来源：原理  

作者：糖兽  

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