华人研究组Cell发布CRISPR研究新突破：I型CRISPR复合体作用机制

康奈尔大学分子生物学和遗传学系的Ailong Ke教授研究组主要从事CRISPR、RNA生物学、RNA分子结构和功能、结构生物学等方面的研究，在核酸开关领域研究成果处于世界顶尖水平。近期其研究组与哈佛医学院Maofu Liao研究组合作，公布了嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）的I型CRISPR复合体的近原子分辨率结构，并从中揭示了CRISPR-Cas3这一系统的作用机制。

这一研究成果公布在6月29日的Cell杂志上。

这项研究成果的突破所在：

新研究获得了近原子分辨率的结构图像，解析了CRISPR如何搜索靶标DNA，并制备可以用于Cas3酶切割的DNA的关键步骤；

研究结果揭示了防止意外基因组损伤发生的多层错误检测机制；

这项研究为提高CRISPR系统基因编辑的准确性提供了结构性理解，这将能有助于减少脱靶效应。

CRISPR-Cas3系统

CRISPR-Cas获得性免疫系统大体上可以分为三个主要类型和11个亚型类型。I型CRISPR-Cas系统包含Cas3蛋白。II型以Cas9为标志蛋白。Ⅲ型 CRISPR-Cas系统又被分为2个亚型：ⅢA和ⅢB，具有标志蛋白Cas6。I型CRISPR-Cas系统存在于细菌和古细菌中，入侵的外源DNA被cascade-crRNA复合物识别，cascade-crRNA复合物沿着序列进行扫描，最终特异性结合在一个含有PAM元件（NGG）的位点，crRNA的前6-12nt对靶位点结合至关重要，随后Cas3核酸酶切割目标DNA，这需要ATP和Mg2+参与。

2012年，由由多伦多大学Alan R. Davidson和Karen L. Maxwell领导的研究小组，在Nature杂志上发表研究论文，第一次证实一些基因介导了对CRISPR/Cas系统的抑制作用。他们在感染绿脓杆菌的细菌噬菌体中发现了5个不同的I-F型 “anti-CRISPR”基因。指出噬菌体编码的这些anti-CRISPR有可能代表了噬菌体战胜非常普遍的CRISPR/Cas系统的一种广泛的机制。

在发表于2015年9月的Nature研究论文中，这一多伦多大学研究小组公布三种anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能机制。证实每一个anti-CRISPR蛋白都通过不同的机制来抑制了CRISPR–Cas的活性。第三种anti-CRISPR蛋白AcrF3通过结合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到结合DNA的CRISPR–Cas复合物上来起作用。在体内，这一anti-CRISPR可以将CRISPR–Cas系统转变为转录遏制物，首次证实了一种蛋白质相互作用蛋白可以调控CRISPR–Cas活性。

因此可以说作为CRISPR-Cas系统的亚型，CRISPR-Cas3是生物医学研究中广泛应用的精密基因编辑分子工具。然而，在其作用机制方面，特别是如何捕获靶DNA，目前尚不清楚，而且目前存在的意外脱靶问题也是阻隔这一系统在临床上应用的拦路虎。

CRISPR-Cas3结构揭示其精确切割过程

在这篇文章中，研究人员利用生化技术和冷冻电子显微镜技术，得到了不同的功能状态下的稳定复合物结构，观察到了CRISPR复合物靶向目标DNA链，并准备通过Cas3酶切割DNA的全过程。研究人员表示这些结构有助于揭示多层错误检测的过程，这一过程可以防止出现意外的基因组损伤。

文章作者之一，哈佛医学院助理教授Maofu Liao表示，“要解决特异性这个问题，我们需要了解CRISPR复合物形成的每一个关键步骤。这项研究报道了CRISPR如何捕获DNA的准确机制，包括从初始识别靶标DNA，到构象变化的全过程，这样DNA就可以通过Cas3进行最终切割了。”

研究人员还发现在CRISPR-Cas3中，crRNA被添加到CRISPR蛋白复合物上，当CRISPR复合物发现PAM序列，就会让DNA呈锐角弯曲，迫使一小段DNA解链。这允许crRNA的一个长11nt的片段结合到靶DNA链上，形成“seed bubble”。这个结构能起到自动防故障装置的作用，检查靶DNA是否匹配crRNA，如果它们正确匹配，则气泡扩大，并且其余的crRNA与其相应的靶DNA结合，形成所谓的“R-环”结构。

一旦这种R环完全形成，这种CRISPR复合体就发生构象变化，将靶标DNA锁定。同时也让DNA的第二条非靶标链形成一个凸起，这样形成完整的R-环结构，就能被Cas3酶切

来源：生物通   作者：万纹