【视频】神经疾病研究的里程碑式进展：DART技术

动物的行为受脑中分子、细胞和环路活动的调节，但由于缺乏合适的方法，研究特定细胞中的特定蛋白如何调节行为却是一个巨大的挑战，对此问题的理解在神经疾病的研究及相应疗法的开发中非常关键。现在，我们迎来了针对上述问题的重大技术进展。昨日，Science重点报道了Michael R. Tadross博士的工作[1]，他们研发了一种被称作DART的技术，并成功地对特定细胞的AMPA受体进行了药物干预，研究了帕金森病相关运动缺陷的分子机制，为解析行为的分子机制提供了全新研究手段。

DART技术介绍：

目前应用于动物行为研究的工具包括传统的药理学、基因改造的工具（如光遗传、化学遗传工具）和基因编辑技术，但这些技术各有其优缺点。传统药理学拥有靶向蛋白准确和作用迅速的优点，但细胞特异性差（图1A第一行）；基因改造的工具虽然细胞特异性强、作用迅速，但其靶向的细胞，无法特异操作细胞上的特定蛋白（图1A第二行）；基因编辑技术同时具有细胞特异性和蛋白特异性，但耗时长（图1A第三行）。

为了研究特定细胞的特定蛋白在行为和疾病中的作用，我们需要同时具有细胞、蛋白特异性，又作用迅速的工具，而DART技术具有上述所有优点（图1C）。

图1 DART技术的原理及与其他技术的比较

DART技术全称为Drugs acutely restricted by tethering，其原理如图1B。DART系统中，作者在一种改造的细菌酶HaloTag上连接了TM跨膜区域，这样HaloTag就可以独立表达并锚定在细胞膜上，同时不影响细胞本身蛋白的表达。此后，作者通过改造HaloTag的配体HTL（末端连接药物Rx），达到了HTL与HaloTag结合、将药物靶向性作用于特定受体的效果（图1B）。换句话说，作者在神经元上转入了一个锚定位点，该位点指引着药物来到该处行使作用，类似药物的“导航系统”。

DART技术的验证（培养神经元）

作者首先在培养的神经元上验证DART系统，他们选择AMPA受体作为研究对象。如图2，作者在突触前神经元转入光敏感通道ChR2，在突触后神经元转入GCaMP6s，同时在部分突触后神经元转入了HaloTagTM-2A-dTomato（图2D黄色，HT+）或对照（图2D绿色，HT-），随后通过检测光刺激在突触后神经元引起的反应，检验DART系统的效用。

图2 DART技术特异性控制特定细胞AMPA受体的活动

结果发现系统加入AMPA受体阻断剂YM90K结合的Rx-HTL(YM90K-DART)后，HT+细胞AMPA受体活动被完全抑制，而HT-细胞不受影响（图2E-F）；同时，HT+细胞的NMDA受体活动不受影响（图2G-H，下方视频）。这些结果充分说明了DART系统的细胞受体特异性。

DART技术的验证（纹状体脑切片）

接下来，作者在纹状体脑片验证DART技术的有效性。他们在已知的皮层-纹状体通路注射ChR2，利用Cre系统在纹状体SPN神经元表达HaloTagTM（HT+）或对照（HT-），随后通过YM90K-DART的药物成功验证了DART技术。

图3 DART技术在纹状体脑片的功能验证

DART技术的验证（动物行为）

过去研究表明，改变单侧纹状体神经元活动会导致动物转身方向发生偏好。因而作者接下来在纹状体D1和D2神经元分别转入HaloTagTM(AAV2/1-DIO-HaloTagTM-2A-dTomato)（图4A），利用YM90K-DART检验DART系统。结果发现，对D1神经元的操作使动物总是左转，而对D2神经元的操作则使动物总是右转（图4B，下方视频），这说明DART技术能够区分同一脑区不同细胞所涉及的行为。

图4 DART技术在动物行为中的应用

DART技术研究AMPA受体与帕金森相关运动缺陷

最后，作者利用DART技术研究了特定细胞AMPA受体与帕金森病相关的运动缺陷的关系。他们在左侧纹状体D1或者D2神经元表达HaloTagTM，并在左侧MFB脑区注射6-OHDA阻断左侧脑区多巴胺投射，构建帕金森模型，可以明显看到6-OHDA阻断后的小鼠的运动转向总是向左（图5D-F，黑色，视频3）。而一旦在D2细胞表达HaloTagTM的小鼠上给予YM90K-DART，则能逆转这种转向偏好，D1细胞组无变化（图5D-F，下方视频）。这些结果说明纹状体D2细胞的AMPA受体与帕金森病相关的运动缺陷密切相关。

图5 利用DART技术研究帕金森相关运动缺陷的受体机制

总结：

Michael R. Tadross博士的工作开发了一种全新的DART技术，利用该技术结合特异启动子、病毒载体等工具，我们可以定向的研究特定脑区、特定细胞上的特定蛋白在行为和疾病中的作用，为疾病的机制研究和治疗发展奠定了里程碑式的基础。

参考文献

[1]  Brenda C. Shields, Elizabeth Kahuno, Charles Kim, Pierre F. Apostolides, Jennifer Brown, Sarah Lindo, Brett D. Mensh, Joshua T. Dudman, Luke D. Lavis, Michael R. Tadross. Deconstructing behavioral neuropharmacology with cellular specificity. Science. 356, 42 (2017)

来源：和元上海（微信号 oobio_server）