肿瘤细胞免疫治疗之CAR-T技术（上）：技术优势、风险与几大应用场景

一、CAR-T技术原理

（一）过继性细胞治疗

过继性细胞治疗是细胞的免疫治疗一个主要研究方向。过继免疫细胞输注（adoptive cell transfer, ACT）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞( tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内。

在恶性黑色素瘤和肾细胞癌，TIL是常用的ACT治疗。TIL是浸润于肿瘤中的淋巴细胞，分离后在IL-2等因子作用下进行体外扩增，最后再回输到患者体内。然而，多数情况下无法应用TIL：有些患者缺乏肿瘤标本或肿瘤和转移灶中TIL很少；获得新鲜的肿瘤组织并分离和扩增TIL 具有难度；回输的TIL 细胞功能受损，在体内往往不能有效识别肿瘤细胞; 肿瘤中强大的免疫抑制微环境降低回输细胞的杀伤能力。这些问题限制了TIL的广泛应用，仅对如恶性黑色素瘤和肾细胞癌的少数肿瘤有一定疗效，对大多数肿瘤疗效欠佳。

在这种情况下，ACT需要使用外周血淋巴细胞。目前使用外周血淋巴细胞的ACT包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells，LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）、树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞（dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK）、抗CD3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti-CD3 antibody-induced activated killer cells, CD3-AK cells）等。然而CIK等是非特异性活化的淋巴细胞，缺乏肿瘤特异性反应能力。

在这种情况下，科学家开始通过基因修饰，将识别肿瘤抗原的T细胞受体（T cell receptor, TCR）或CAR基因导入淋巴细胞使之成为TCR基因修饰T淋巴细胞（TCR-T）或CAR-T细胞，使之具备肿瘤抗原靶向识别能力。

（二）CAR-T的治疗过程

简单来说，CAR-T治疗过程为包括从病人外周血中分离淋巴细胞T细胞，通过基因载体将肿瘤抗原特异性CAR基因转导入T细胞，生成CAR-T细胞，经体外扩增达到一定数量后静脉回输给患者。由于被转录的CAR基因编辑的功能，回输的CAR-T可以特异性结合癌症细胞，从而达到靶向治疗的作用。

（三）CAR-T的结构

1.3.1 CARs结构总览

CARs是靶向目标表面分子的重组受体，其结构主要包括胞外抗原结合域、跨膜区和胞内信号区三部分，对每个区域的不同设计影响CAR-T细胞功能的发挥。

1.3.2 胞外抗原结合域

胞外区源于单链抗体ScFv，由轻链和重链共同组成，负责抗原的识别。这种识别本质上是抗体与抗原的特异性结合，不需要依赖于MHC的递呈，有效避免了肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。CAR不仅能够识别肽类抗原，还能识别糖类和糖脂类抗原，更加广谱地杀伤肿瘤细胞。

目前已设计出的ScFv可识别抗原包括CD19、CD20、EGFR、Her2/neu、GD2、PSMA及RORI等。

1.3.3 跨膜区

跨膜区连接胞内区和胞外区，一般由二聚体膜蛋白组成，将CARs结构锚定于T 细胞膜上。

跨膜区的不同设计影响导入的CAR基因的表达能力。有文献证实包含CD28的TM区的CAR表达能力最强，其次是包含OX40的CAR，而包含CD3ζ的CAR表达能力最差。目前设计用于CAR的TM区主要包括H2-Kb、CD4、CD7、CD8、CD28等。

1.3.4 胞内信号域

胞内信号域采用免疫受体酪氨酸活化基序( immune-receptor tyrosine-based activation motifs，ITAM) ，通常是 TCRζ（CD-3ζ）或FcRγ，当胞外区ScFv与其识别的抗原结合时，就会向胞内传导 TCＲ 样信号。根据胞内区结构不同，可将CAR-T分为四代。

1.3.5 CARs结构变迁

根据胞内区结构不同，CARs结构经历了从第一代到第四代的变迁。

图源：中国知网

第一代CAR只有一个胞内信号组份，主要是CD-3ζ或FcRγ。当第一代CAR受到特异性抗原识别并激发后，可为T细胞提供活化信号，并通过胞内结构域传导该信号，引起细胞的活化，表现为CAR依赖的细胞活化及细胞杀伤作用，分泌穿孔蛋白、颗粒酶及细胞因子，协同作用杀死肿瘤细胞。早期的实验证明了CAR-T的可行性，是首次不依赖人类白细胞抗原进行T细胞激活的尝试。然而，第一代CAR只能引起短暂地激活T细胞和分泌较低水平的细胞因子，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。

为了解决这个问题，从第二代CAR开始引入了共刺激分子信号序列（costimulatory molecule，CM），如CD28、CD137（4-1BB）。与第一代CAR相比，第二代CAR含有一个活化结构域和一个共刺激区域，在保持抗原特异性一致的情况下，增强了T细胞增殖和细胞因子分泌的功能。

第三代CAR在前一版本上升级，胞内部分则由活化结构域和多重共刺激区域组成，具有三个胞内信号域，其中包括两个串联的共刺激域CD28、4-1BB或OX40和一个CD-3ζ。这些结构域的增加不仅能够加强CAR-T细胞特异性识别肿瘤抗原及结合等能力，更能够显着扩大由胞外区传递的细胞信号，引起下级细胞杀伤作用的级联放大，抗肿瘤能力更强。

第四代CAR是最近出现的新型CAR，又称TRUCKs ( fourth-generation CAR T-cells redirected for universal cytokine killing)。它的结构与前三代不同，引入促炎症细胞因子(如IL-12) 和共刺激配体( 4-1BBL 和CD40L) ，可以在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中通过释放促炎性因子，招募并活化更多的免疫细胞而引起更为广泛的抗肿瘤免疫效应。同时，第四代CAR的出现可使患者免受回输前预处理治疗（如全身照射或大剂量化疗）的不良反应，减少回输细胞总量，拓宽了CAR-T 细胞的临床应用范围。

（四）CAR-T的抗体结构

1.4.1 传统抗体

图源：Absolute Antibody

传统抗体是分子量为150 k Da的四聚体多肽，由两对相同的重链（50 k Da）和轻链（25k Da）多肽组成，二者由链间的二硫键链接，形成Y型或T型结构。其中，轻链由N端的可变区（VL）和C端的一个保守的区域(CL)构成；重链由N端的可变区（VH）和三至四个恒定的区域（CH1,CH2,CH3,可能CH4）组成。

可变区的多样性决定了抗体的多样性与特异性，使得抗体具有结合特定抗原的能力。比较不同特异性抗体的VL和VH的氨基酸顺序显示，变异仅集中在其中少数区域的氨基酸上(15％～20％)，称为超变区。超变区是抗体的抗原结合位，与抗原决定簇的结构互补，故又称为互补决定区(complementarity－determining regions，CDRs)。

胞外抗原结合域源于抗体的抗原结合基序，可以连接受体上的VH和VL区域，形成单链可变区scFvs，从而特异性识别肿瘤抗原。

1.4.2 纳米抗体

骆驼和鲨鱼类动物体内存在着天然缺失轻链的重链抗体，由体内两条同源的重链肽段组成，相对分子质量为90 kDa。如果克隆其可变区VHH，将得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的最小单位，又称纳米抗体，相对分子质量仅为15 kDa，仅为常规抗体的1/10左右。

纳米抗体的VHH和人抗体重链可变区VH结构非常相似，其基因同源性达90%。纳米抗体VHH表面大概只有10个氨基酸和人VH不同，其中在FR2位置有四个特异的氨基酸：普通抗体的FR2中V37、G44、L45和W47这4个氨基酸残基是在进化中相当保守的疏水性残基；而在VHH中，它们突变为亲水性的氨基酸残基F37、E44、R45、G47，增加了VHH的溶解性。

VHH的CDR1区和骨架区FR2存在半胱氨酸残基(Cys)，可以和CDR3区中的Cys残基形成二硫桥，增加了可变区的稳定性和结构变化。VHH的FR2区中特殊的亲水性氨基酸残基的改变和CDR3区二硫键的存在，也使得其稳定性和亲水性也远远优于传统的抗体。

VH 和VHH 结构示意图

相比于传统CAR-T，搭载纳米抗体的CAR-T在性能上有更多优势。

（五）CAR-T的基因修饰方法

稳定转染是效应T细胞稳定表达CAR的前提。目前用于CAR-T的基因转导的方法主要有逆转录病毒转导、慢病毒转导和mRNA转染。

逆转录病毒科包含七个成员，其中γ-逆转录病毒已成为治疗恶性肿瘤的临床基因转移常用载体。然而近年来，由于逆转录病毒转导有引起插入致瘤的风险、不能感染非分裂细胞、病毒滴度低等问题，在临床试验中已经逐渐被慢病毒转导所取代。

慢病毒载体含有顺式作用元件中央多聚嘌呤区，因而慢病毒不受细胞分裂的控制，能够在更广泛的细胞类型里进行有效的转导，包括静止细胞的转导。并且，慢病毒载体的整合位点更安全，转基因负荷量更大，基因毒性更小。在靶向CD19的CAR-T临床试验中，慢病毒传染的CAR-T显示出更显着的抗肿瘤效力。

当需要获得短暂存在的CAR-T细胞时，则需要用到mRNA转染。mRNA转染是一种快速高效的转染方式，T细胞在一周内瞬时表达，不能稳定持久存在，往往需要输注大量的T细胞才能够保证疗效。

（六）CAR-T技术的优势

总的来说，从原理、结构和制作工艺上，目前的CAR-T都比TIL和TCR更有优势。

一、CAR-T细胞不受MHC限制，是抗原与抗体的特异性识别，能够更加有效地杀伤具备抗原特异性的肿瘤细胞。而TIL和TCR均只能识别MHC提呈的抗原，可能因肿瘤细胞下调或突变其MHC分子而逃避免疫监视，临床上有一定局限性。

二、CAR-T细胞疗法使用剂量比TIL和TCR-T下降了2--3个数量级。由于CAR-T细胞治疗靶点明确，具有高度识别肿瘤表面抗原的特异性，同时克服了 MHC限制性，因而在同样的治疗效果下，CAR-T疗法的单次注输细胞数量（1000万-1亿）远远少于TCR-T（10亿-100亿）和TIL（100亿-1500亿）。

三、CAR-T细胞疗法所需时间更短。由于同等治疗效果下CAR-T所需细胞数量更少，因而CAR-T培养T细胞所需时间最短。体外培育周期缩短至2周，大幅节约了时间成本。

四、CAR不仅能够识别肽类抗原，还能识别糖类和糖脂类抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围。出来不受MHC限制，CAR-T疗法也不受肿瘤细胞的蛋白质抗原限制，CAR-T可以利用肿瘤细胞的糖脂类非蛋白质抗原，更能够多维度识别抗原。

五、CAR-T具有一定的广谱可复制性。由于某些位点会在多种肿瘤细胞中表达，如EGFR，针对这种抗原的CAR基因一旦构建完成，便可以被广泛利用。

六、CAR-T细胞具有免疫记忆功能，能够长期在体内存活。这对预防肿瘤复发具有重要临床意义。

（七）CAR-T技术的风险与解决方案

1.7.1 脱靶效应（off-target toxicity ）

脱靶效应（off-target toxicity）是所有过继性细胞免疫治疗的共性问题，它的概念要和正常组织毒性（on-target toxicity）区别开。

正常组织毒性指基因修饰T细胞对同样表达其靶点的正常组织的毒性。脱靶效应是指基因修饰T细胞对不表达这些靶分子的正常组织或器官的毒性。

如何鉴定出肿瘤细胞上合适的免疫原性的靶点，从而使得CAR-T细胞只攻击肿瘤细胞而不损伤正常组织，是CAR-T发展的关键。有一种做法是，通过设计多个抗原复合的CAR结构，识别抗原组合，能够提高杀伤的特异性，如Wilkie实验室使用同时靶向抗原ErbB2和MUC1的CAR-T治疗乳腺癌。

1.7.2  细胞因子风暴( cytokine release syndrome，CRS)

当CAR-T细胞被回输至体内，细胞治疗过程中会释放的大量细胞因子，包括 IL-6、TNFα 和 IFNγ，这些炎性介质促发急性炎症反应诱导上皮及组织损伤，导致微血管渗漏等机体多种免疫炎症反应，称之为细胞因子风暴( cytokine release syndrome，CRS)。CRS发生于超过半数的CAR-T受试者，是最常见的不良反应之一。

CRS可发生于细胞输注后2-3周，常见症状为发热、寒战、疲劳、低血压、恶心、头痛、心动过速、呼吸困难，以及心、肝、肾功能异常等。

CRS的发生于CAR的结构、肿瘤负荷及类型以及患者基因多态性相关，可通过设计安全的CARs并严格限制每次输注的细胞数量来降低发生风险。或者可导入一个安全开关控制基因，如可诱导的Caspase 9，当此基因被某种可溶性的因子诱导表达时，可引起 CAR-T细胞凋亡，有助于降低细胞的毒性反应。并且，当CRS发生后，也可利用托珠单抗等药物进行治疗、控制。

1.7.3 神经毒性

另一常见的不良反应为神经毒性。在成功利用托珠单抗治疗CRS之后，神经毒性已成为CAR-T治疗过程中的主要生命威胁事件，其发生机制仍有待探索。

多项临床试验曾报道包括脑梗死、谵妄、意识不清、抽搐、神经麻痹、视野缺损、共济失调、言语障碍在内的多种神经系统异常症状。

美国Juno Therapeutics公司正是因其临床试验中出现5例不可预期的脑水肿死亡，而不得不宣布关停“火箭计划”项目的临床试验。Juno分析推测神经毒性可能由预处理化疗药物氟达拉滨或CAR-T产品结构中的CD28共刺激结构域引起。

1.7.4 其他毒副作用

CAR-T尚有某些其他的毒副作用，如出凝血功能障碍、B细胞发育不良等。

其中凝血功能障碍主要表现为散在瘀斑瘀点、血栓形成及实验室指标异常，如血小板减少、D-二聚体升高、纤维蛋白原降低、纤维蛋白降解产物升高、活化部分凝血活酶时间延长等。

B细胞发育不良则主要是因为针对肿瘤细胞的靶点（如CD19）同样表达于正常B细胞表面，从而CAR-T细胞在清除肿瘤细胞的同时也会杀灭正常B细胞。且CAR-T细胞可在体内长期存续和发挥作用，因此患者体内可长期缺乏正常B细胞，造成丙种球蛋白低下，易形成感染。因此患者需要适当补充丙种球蛋白提高免疫力作为预防措施。

当CAR-T应用于实体瘤治疗时，还可能造成CAR-T细胞归巢和免疫抑制肿瘤微环境等问题。

来源：探针资本

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