【人物】李大力Crispr/Cas9技术的经验之谈_医疗器械

2015

07/13

10:52

生物谷医疗器械

李教授您好，作为Crispr/Cas9技术方面的专家，您认为Crispr/Cas9技术的有点有哪些？最大的应用价值在哪里？

李大力：专家谈不上，我们只是比较早的接触CRISPR/Cas系统为代表的基因编辑技术并开展相关研究。Crispr/Cas9在现有基因编辑和基因修饰的技术里面，是效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的一个技术，以至于在非常短的时间内风靡全球。这个技术只要一条sgRNA加上通用的Cas9蛋白就可以对几乎所有的DNA序列进行定点切割，应用领域十分广泛。可以说只要能进行核酸导入操作的物种都可以成为其改造的对象，体外培养的细胞也好、植物也好、动物也好、细菌也好，运用Crispr/Cas9技术都能实现比较高效的基因编辑。

随着对基因研究的不断深入，科学家们对于某些基因的功能有了一定的了解。特别是对于一些有利于生产性状改善的基因功能的深入研究，人们希望通过对这些基因进行特异性的操作来为人类的生产生活服务。基因编辑可以通过改变内源基因而尽可能的避免引入外源基因片段来对目的基因组进行精确高效的操作，这是传统的转基因技术所不具备的优势。目前很多应用层面的工作已经展开，比如通过基因改造使作物提高产量，产生抗病基因；构建动物模型研究疾病；构建微生物用于工业发酵生产；最终直接使用基因编辑技术进行疾病的治疗等。当然，这些应用性研究还处于起步阶段，还有大量的工作要做。除了生产应用方面的研究，基因编辑技术对于基因功能等基础理论研究也显示出令人振奋的潜力。除了对单个基因进行敲除和敲入等操作，还能运用sgRNA文库进行全基因组筛选，其准确性远高于之前的shRNA文库筛选。

对于我们来说，主要是用基因编辑技术构建基因敲入或敲除的动物模型，通过动物模型来研究一些疾病的机制。而Crispr/Cas9技术使我们的工作更加高效和便捷，以前很多难以实现的想法，都可以通过Crispr/Cas9基因改造来进行研究。Crispr/Cas9作为一个高效实用的技术，未来将会随着基因编辑技术的推广，越发显示出自身的价值。

一些观点认为Crispr/Cas9可能带入无意义的基因片段，且靶向编辑的效率太低，并且经常出现脱靶，对此您是怎么解决的？

李大力：脱靶和效率肯定是大家比较关心的，谁都不想看到一个令人兴奋的表型通过仔细鉴定最后发现是由于脱靶而产生的，这肯定是一个大问题。脱靶问题在细胞系中比较突出，当然也有一些解决方案。例如针对一个基因可以利用两个以上sgRNA分别构建敲除细胞系来进行相互验证，也可以利用double-nicking的方法利用一对相邻的sgRNA指导Cas9 nickase在两条DNA互补链上分别产生Nick而造成DNA双链断裂。通过这种方法虽然会牺牲一些效率，但是准确性会大大提高。

从我自己的研究来说，我们主要是做小鼠大鼠这类哺乳动物模型的，通常使用的手段是受精卵注射。通过我们自己大量的研究，以及查阅别人的文献，我们发现Crispr/Cas9技术在动物研究领域的脱靶效率相对来说比较低。这主要是因为动物模型制备中主要是注射活性时间较短的Cas9 mRNA或者蛋白质，cas9的表达量和作用时间与细胞中的质粒转染相比表达量和活性更容易控制，大大降低了脱靶的发生。而且，即便是F0代的动物有脱靶，在传代的过程中，由于研究者会通过基因型鉴定保留on-target的突变而不会去筛选或保留脱靶位点，这样脱靶的突变在经过几次传代之后基本上会逐渐消失。另一点就是，脱靶的位点绝大多数都是在DNA中的非编码区，对于动物来说可能不大会有由于脱靶而产生的表型。

我们自己做实验以及给第三方提供一些服务的时候，还会有一些保险措施。比如我们会设计不同的sgRNA靶点，不同的sgRNA脱靶位点肯定是不一样的，通过比较两个sgRNA靶点构建的小鼠表型是否一致，也就可以验证是否在构建过程中存在造成表型的脱靶现象。另外在sgRNA的设计上，有网站可以预测它潜在的脱靶位点，我们会尽量选择脱靶位点少的。即便有潜在脱靶位点，也尽量选择脱靶位点在基因间的区域。因此在动物模型构建中，脱靶的负面效应还是比较容易解决的。

李教授您主持了数项国自然项目，以及国家973、市级项目等，那您最近正在进行一些什么样的工作？能否为我们介绍一下。

李明：好的，基因编辑、构建动物模型这些工作是我们的主要任务之一，平时我们会有目的地构建一些对大家研究有帮助的动物模型，以及那些由于种种限制，已经在国外发表但很难被引进到国内的动物模型，然后通过合作的方式让国内的科研人员都可以共享这样的成果。

此外，我们现在还承担了上海市科委的上海市信号转导的公共服务平台，基因修饰动物模型构建服务是这个平台里重要的一个组成部分。通过这个技术平台，我们这两年来已经提供基因修饰动物模型构建服务150多项，完成200多个基因修饰模型的构建。科委对我们也有一些要求，希望我们这个平台能够真正做到为大众服务。因此目前我们通过和邦耀生物科技公司进行合作，他们会在商业和宣传上给我们提供帮助，让我们的研究成果可以帮助更多科研人员进行深入有效的研究工作。

您的研究工作都是依赖于大量的基因修饰动物模型，这些动物模型的培养和基因编辑都是您的团队独自完成的吗？您是如何建立这样一套体系的？

李大力：我们在华师大这边的技术平台，基本上都是我一个人建起来的。当时从国外回来之后，从无到有，从建动物房开始，包括购买仪器、培训技术员等。通过一段时间的努力，我们建立了大鼠和小鼠的转基因技术体系，正好碰上基因编辑技术的迅猛发展，很幸运的我们在国内首次报导了利用TALEN技术构建基因突变小鼠的技术体系；同时，我们与中科院周琪老师课题组在世界上率先发表CRISPR/Cas系统在大鼠基因修饰模型构建中的应用。现在我们有一个稳定、完整的技术团队，能非常出色的完成载体构建、显微注射、基因型鉴定到种质保存等各个环节。

当然，我们自己团队的人员主要都是在做科研，有的还有自己的教学任务，不可能去做一些商业上或者平台推广的工作。因此我们有了一些研究成果之后，也希望能够找一个合作者，对我们的成果进行宣传，把我们这个平台告诉大家，大家也可以通过和他们洽谈，获得我们的动物品种以及服务项目。目前我们就是通过邦耀生物科技公司进行在商业上和宣传方面的合作的。在这样的合作环境下，我和我们团队的其他成员也可以更专注于科研方面的工作，研发构建更好的动物模型为国内科研工作者服务。

您对于基因编辑技术在人类疾病治疗方面的应用有什么看法？

李大力：最近，利用锌指核酶这一基因编辑技术在T细胞中敲除HIV受体CCR5基因已经在进行临床试验，而且取得了可喜的进展。这对于使用基因编辑技术进行疾病治疗这一领域来说，是非常鼓舞人心的。前面我们也谈到基因编辑技术中的脱靶问题，这应该是制约其临床应用的最大风险因素。从技术层面来说，直接把致病基因进行敲除来达到治疗的目的，实现起来相对容易。但很多疾病是由于突变造成基因功能缺失而导致的，对于这样的疾病必需通过精确的修复才可能有治疗效果。要将基因编辑直接用于这一类疾病治疗还有一段路要走的。此外，虽然Crispr/Cas9切割的效率很高，但是同源重组的效率非常低，如果真正要做到治疗，同源重组效率的提高与脱靶风险的降低是同样重要的尚待解决的问题。

我个人的观点是先做细胞层面的基因修复，然后将修复好的细胞导入体内进行治疗，这可能是比较有前景的一个途径。但现阶段我们做的比较多的工作是通过已有的模型，使用不同的方式来治疗，研究治疗效果。这样的研究对于临床治疗来说，也会有很大的帮助。基因编辑真正应用于人类疾病治疗还有很长的路要走，但是科学的发展我觉得就是每个人贡献自己的力量，一步一步向前，最后实现造福于人类的目标。

对于这些研究的成果转化，您有没有进一步的规划和考虑？

李大力：没错，成果转化是非常重要的一点。但是对任何一个研究工作者来说，一个人的力量或者一个团队的力量都是很有限的，所以我们的规划是希望和更多领域的研究者进行合作，通过大家的力量来真正实现成果转化。我个人的兴趣主要还是在基础研究上，但我们是一个非常开放的团队，理念是立足于自己的优势，结合大家共同的长处来一起做科研，做出真正有影响力度的原创性成果。

李大力人物简介：

研究员

上海市调控生物学重点实验室副主任

生物化学与分子生物学学科副主任

2007年获得美国德州农工大学和湖南师范大学联合培养博士学位，同年受聘于华东师范大学生命科学学院从事教学与科研工作, 于2009 年破格晋升为副教授,2014年破格晋升为研究员。目前为华东师范大学转基因动物中心负责人。2011年开始任上海市调控生物学重点实验室副主任，负责日常工作。

近年来在国际知名生物学期刊Nature Biotechnology, Nucleic Acids Research，Development和Endocrinology等杂志上发表研究论文30余篇。主持国家自然科学基金3项，上海市项目1项，同时作为学术骨干参与国家973项目1项，参与省部级课题多项。

研究课题

主持国家自然科学基金3项：

青春发育关键基因KiSS1表达调控研究（No.30800627 2009-2011）

核仁蛋白PAK1IP1 调节核糖体生物合成的功能及机理研究（No.31171318 2012-2015）

七次跨膜受体Lgr4 及其配体家族在卵巢功能维持和雌性不育中的功能研究 (No.31371455 2014-2017)

主持上海市课题1项: