深度：T细胞受体疗法治疗实体瘤的机遇和挑战

T细胞受体（T cell receptor，TCR）疗法和嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞疗法是利用患者自身的T淋巴细胞治疗癌症的两类前沿基因疗法。由于CAR-T细胞疗法进来取得的卓越成功，TCR疗法的研究相对不那么引人关注。但是在治疗实体瘤方面，TCR疗法可能比CAR疗法更有优势。“靶向实体瘤来说，TCRs通往成功的道路可能比CARs要更短一些，”Fred Hutchinson癌症研究中心的Phil Greenberg博士说。日前，《自然》子刊专门撰文分析了TCR疗法在治疗实体瘤方面的机遇和挑战。

TCR与CAR疗法比较

TCR和CAR疗法都对患者自身的T淋巴细胞在体外进行改造，然后将它们注回患者体内杀伤肿瘤的癌症疗法，但是它们识别抗原的机制截然不同。TCRs利用α和β肽链构成的异元二聚体（heterodimer）来识别由主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）呈现在细胞表面的多肽片段。而CARs则利用能够与特定抗原结合的抗体片段来识别肿瘤细胞表面的抗原。因为MHC分子能够呈现从细胞表面和细胞内蛋白中获得的肽链，TCRs与CARs相比，能够靶向更多种抗原。

因为MHC分子能够呈现从细胞表面和细胞内蛋白中获得的肽链，TCRs与CARs相比，能够靶向更多种抗原。（图片来源：《Nature Biotechnology》）

理论上讲，在治疗实体瘤方面TCRs与CARs相比有着明显的优势。“CAR-T细胞治疗实体瘤方面的问题是因为它们的靶点抗原都是细胞表面蛋白，”Adaptimmune公司的联合创始人Bent Jakobsen博士说。“我不知道是不是存在对人类癌症具有特异性的细胞表面蛋白，”约翰·霍普金斯大学（Johns Hopkins University）的免疫学家Jonathan Schneck博士说：“即便CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的功能卓越，如果没有合适的靶点我们也无法对实体瘤产生真正的影响。”

而TCRs靶向的细胞内蛋白具备肿瘤特异性。这些抗原包括由于肿瘤DNA的随机突变造成的新抗原（neoantigen）和所谓的癌睾丸抗原（cancer testis antigens）。这些抗原通常只在某些肿瘤和生殖系组织（germline tissue）中表达，而生殖系组织不会表达MHC。

而且，表达TCR的T细胞通常侵入肿瘤内部的能力会强于CARs，而CARs通常会附着在肿瘤的外层而不向内部渗透。这是因为CAR靶向的抗原可能在肿瘤表面有上千个拷贝，它们会在CARs渗透到肿瘤内部之前就将它们都吸收了。而TCRs在最初碰到肿瘤时遇到的抗原可能少于50个拷贝，这让CARs能够进一步深入肿瘤内部与抗原结合，从而保证更均衡的药物分布。

TCR疗法的起步和挑战

TCR疗法的概念其实早于CARs产生。1986年，在巴塞尔免疫研究所（Basel Institute for Immunology）工作的Michael Steinmetz博士第一次将一个T细胞的TCR基因转移到另一个T细胞中，从而赋予第二个T细胞相同的抗原特异性。这是当今TCR基因疗法的祖先。上世纪末，在美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）的Steve Rosenberg博士和Phil Greenberg博士率领的研究团队证明可以通过分离特定TCR赋予T细胞新的抗原特异性。2004年，Rosenberg博士的团队启动了第一个TCR基因疗法的临床试验，接受治疗的15名黑色素瘤患者中有两位的肿瘤达到完全缓解。这些患者自身的T细胞在体外得到扩增，并且在细胞中表达了对MART-1抗原具有特异性的TCRs。

Steve Rosenberg博士（图片来源：By Rhoda Baer （Photographer） [Public domain], via Wikimedia Commons）

同时，克隆TCRs并且将它们整合到病毒载体中使它们在T细胞中有效表达的技术日渐完善。2008年以来，多个TCR生物技术公司开始出现。其中Adaptimmune公司在2008年脱离MediGene成为独立公司，Kite Pharma在2009年成立并且随后与NCI达成研究协议。Juno Therapeutics在2013年于西雅图成立。Kite（如今是Gilead的子公司）和Juno（如今被Celgene收购）在开发TCR疗法的同时也在开发CAR疗法。目前至少有16个临床试验正在验证TCR疗法在治疗实体瘤方面的疗效。

目前至少有16个临床试验正在验证TCR疗法在治疗实体瘤方面的疗效。（图片来源：《Nature Biotechnology》）

但是在TCR疗法的开发过程中也遭受过严重的挫折。2011年，在NCI进行的利用靶向癌睾丸抗原MAGE-A3的TCRs治疗实体瘤的临床试验中，头9位患者中有3位患者在接受治疗后立即出现严重精神状态变化，其中两位很快昏迷并且去世。与此同时，宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）的Carl June教授的团队也在使用Adaptimmune公司开发的靶向MAGE-A3的TCRs。头两位接受TCR疗法的患者迅速出现心源性休克（cardiogenic shock），在一周内去世。

后续研究表明NCI 的MAGE-A3 TCR意外地能够与在大脑中的相关多肽MAGE-A12相结合。而Adaptimmune公司的TCR能够与心脏中的肌联蛋白（titin）相结合。肌联蛋白被MHC呈现的多肽与MAGE-A3非常相似。

为了防止类似事件的发生，Adaptimmune公司完全更新了筛查TCR特异性的系统，让研究人员能够确定在整个多肽组（peptidome）中TCR能够与那些多肽结合。这会大幅度提高TCR的安全性。虽然安全性一直是人们关心的问题，但是在最近的临床试验中检验的TCR疗法都表现出可以接受的安全性。

权衡利弊

目前对TCR疗法来说最关键的问题是选择哪种与肿瘤相关的抗原作为靶点。它们可以被分为3大类：过度表达的自身抗原，癌睾丸抗原，和新抗原。每一种类别都有自己的优劣，而Juno, Adaptimmune和Kite三家公司也选择了不同的开发方向。

Juno公司选择的是过度表达的自身抗原。该公司将使用靶向WT1的TCR治疗急性淋巴细胞白血病（acute myeloid leukemia），间皮瘤（mesothelioma）和肺癌，利用靶向间皮素（mesothelin）的TCR治疗胰腺癌的临床试验将在今年开始。WT1和间皮素虽然在有些正常组织中表达，但是在很多肿瘤中高度表达。在某些情况下，TCRs可以在攻击肿瘤细胞的同时对正常细胞没有反应。因为有研究表明可以选择或者改进TCRs，让它们只识别在肿瘤表面高水平表达的抗原。表达这类TCRs的T细胞应该可以安全地杀死肿瘤细胞。这一策略如果成功，意味着可能有上千种肿瘤过度表达的蛋白成为靶点。

但是靶向这类抗原同时也存在着风险，例如，WT1在包括心脏在内的几种关键组织中表达。间皮素在有些组织的间皮细胞中也有低水平的表达，其中包括气管。所以这些疗法有可能带来对健康组织的毒性。

因为这个原因，Adaptimmune公司基本上避免靶向过度表达的自身抗原。该公司选择的是癌睾丸抗原，最初的靶点包括MAGE-A10、MAGE-A4、PRAME和NY-ESO-1。这些抗原的特点是它们在成人组织中几乎不会被处理成为多肽链。癌睾丸抗原的劣势一直是表达这些抗原的癌症种类较少。因此在癌症患者中筛选出适合这一疗法的患者是一个非常昂贵和费时的过程。但是在特定的几种肿瘤患者中，MAGE-A4和PRAME抗原的表达比例很高，因此在这些肿瘤种类中筛选患者是可行的。

例如NY-ESO-1在滑膜肉瘤（synovial sarcoma）中出现的几率高达70%，因此Adaptimmune公司募集这些患者进行了一项临床1/2期试验。在去年六月举行的ASCO年会上该公司公布了其中一个患者群的试验结果：60%的患者对TCR疗法产生反应，其中一名患者达到完全缓解。预计平均总存活期可以达到159周。

新抗原：个体化医疗的可行性

在Juno公司通过谨慎靶向自身抗原来治疗常见癌症，而Adaptimmune的TCR策略将疗法安全性放在首位的同时，NCI的Rosenberg博士和他的团队以及他们在Kite Pharma的合作伙伴尝试在保证安全性的同时，提高可治疗患者的数量。他们选择的是个体化TCR疗法的方向。为了达到这一目标，他们靶向的是肿瘤中出现的新抗原，这些抗原由于肿瘤细胞的DNA突变产生。它的优点是几乎所有癌症患者都会产生新抗原，而且这些新抗原都具备肿瘤特异性。“坏消息是由于每个患者产生的新抗原都不同，这意味着疗法需要对每个患者进行个体化的优化，生产工序将变得非常复杂。”Rosenberg博士说。

使用新抗原作为TCR的靶点首先需要发现这些新抗原，肿瘤细胞DNA上发生的突变只有少量能够导致新抗原的产生，目前没有很好的算法能够从DNA序列的变化预测新抗原的产生。Rosenberg博士的团队将携带患者肿瘤基因突变的DNA序列表达在树突状细胞中，然后检测哪些序列能够产生被MHC呈现的含有突变的多肽链。同时检测从患者身上收集的T淋巴细胞能否对呈现的多肽链产生反应。如果患者的淋巴细胞能够产生反应，这意味着一个新抗原被发现了。研究人员可以收集患者的T淋巴细胞并且富集对新抗原有反应的淋巴细胞作为疗法。

利用这种方法，Rosenberg博士的团队成功在一名胆管癌（cholangiocarcinoma）复发的患者身上发现一种新抗原，将针对这种新抗原的T淋巴细胞进行富集并且注入患者体内导致患者在肺部和肝脏的转移瘤缩小并且反应时间长达2.5年。他的研究团队已经在结肠癌、乳腺癌、胆管癌和宫颈癌患者身上获得过成功。Rosenberg博士的团队目前使用的是利用对新抗原反应性进行富集的T淋巴细胞，可以预见的是下一步研究人员将尝试针对新抗原的TCRs。TCRs的优势是它们可以通过人工设计产生非常高的亲和力。

但是这种个体化的TCR疗法工序能否推广和扩大化是一个有争议的话题。使用目前的制造工艺，整个产生个体化TCR疗法的过程要花费大半年的时间，在这期间患者的癌症将继续恶化。目前限制这一疗法的两大阻碍是TCR克隆和病毒载体的构建和验证。TCR克隆过程通常需要6~8周才能完成，而在良好生产规范（good manufacturing practice, GMP）状态下构建病毒载体并且对它进行安全性检测需要花费6个月的时间和大约25万美元。“目前这种方法无法进行扩大化生产，”Greenberg博士说：“成本实在太高了。”而且通常一个基因突变不会在所有肿瘤细胞中存在，于是你要对多个新抗原做同样的事。肿瘤异质性对所有TCR疗法都是一个挑战，但是靶向单个新抗原可能是一种事倍功半的做法。

Rosenberg博士的团队在使用机器人系统力图用最少的细胞筛选更多基因突变，从而加快TCR的克隆过程。在构建载体方面，病毒载体可能被睡美人转座子（sleeping beauty transposon）系统或CRISPR-Cas9基因编辑系统取代。位于波士顿的Ziopharm公司的转座子系统已经被证明可以将靶向新抗原的TCR成功转移到T细胞中。这一系统已经在几项临床试验中使用。转座子载体的构建和扩增都在质粒DNA中完成，这将大幅度减少与病毒载体相关的花费和监管负担。

虽然研究人员承认靶向新抗原的个体化TCR疗法目前还不完善。“它还是太慢了，太贵了，”Rosenberg博士的长期合作者Nick Restifo博士说：“但是它正在变得更快和更便宜。”更多的生物公司也加大对这一领域的投入。位于麻省剑桥的Neon Therapeutics公司最近与瑞士巴塞尔（Basel）的CRISPR Therapeutics公司达成合作，共同开发基于新抗原的T细胞疗法。“我从来没有想过基于新抗原的TCR疗法能够获得商业成功，”June博士说：“但是它将会发生。”

打破肿瘤耐受的方法

拥有迅速并且廉价的靶向新抗原的TCR系统本身并不足以治愈大多数转移性癌症。因为这些肿瘤通常会制造一个免疫耐受的环境，让针对肿瘤的T细胞无法被正常激活。“最终我们需要的不单是靶向单个新抗原，而是同时带来更广泛的免疫反应，”Jakobsen博士说：“这样你才能打破对肿瘤的免疫耐受状态。这是让免疫系统重新获得控制权的方法。”

目前的免疫疗法很少能够达到这一目标。现有的TCR疗法在缩小肿瘤和启动免疫反应方面能够起到一些作用，但是关键是找到某些能够激发对肿瘤的多克隆免疫反应的方法。将TCRs与免疫检查点抑制剂联合使用可以达到这一目标，但是如PD-1阻断剂一类的免疫检查点抑制剂在携带高基因突变负担的肿瘤中效果最好，在结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中却很少能够起作用。

其它方法包括在TCRs中引入共受体（co-receptor）。“基本上所有在CARs中做过的改进方法你都可以想像在TCRs中进行，”伊利诺伊大学（University of Illinois）的免疫学家David Kranz博士说。另外一种方法是将TCR细胞疗法与激活干扰素基因的激动剂一起使用。

而最明显的激活多克隆肿瘤免疫反应的方法是通过CD4 辅助性T细胞（helper T cells）。CD4细胞能够增强抗原呈现并且通过多种机制加强CD8效应T细胞的功能。比如CD4细胞可以分泌干扰素γ，它能够导致一类和二类MHC分子的表达并且在树突状细胞中提高抗原呈现机制中其它成份的表达。Kranz博士认为在CD4细胞中使用TCR将是下一个重要研究方向。

“这是产生更多CD8和CD4细胞，让它们识别除了你靶向的抗原以外的其它抗原的最好刺激方法，”Jakobsen博士说。癌症免疫学家认为这种抗原表位扩展（epitope spreading）的效应是消灭实体瘤的关键。

CARs 和 TCRs 的未来

一种能够同时帮助CARs和TCRs疗法的技术是Cell Design Labs公司的合成Notch受体（Synthetic Notch Receptor，SynNotch）技术。这种技术能够在细胞中建立一个能够感知组织特异性的SynNotch。它相当于一个开关，让表达在T细胞表面的TCRs或CARs只有在特定组织中才会被激活。SynNotch能够帮助CARs克服在治疗实体瘤方面的最大挑战，那就是没有足够特异性的肿瘤抗原。

June教授认为CAR和TCR疗法最终都将对实体瘤产生作用。而且CARs和TCRs应该合并成为组合疗法，因为肿瘤对这两种疗法产生抗性的方法截然不同。肿瘤通过丢失MHC来逃避TCRs，而对CAR-T细胞的逃逸是通过丢失靶向抗原来完成。肿瘤细胞不太可能同时产生两种抗性，因此CAR-TCR组合疗法能够消灭它们。“因为人类实体瘤的克隆复杂性，我认为只用一种细胞，一个CAR或者一个TCR就能成功是不现实的，”June博士说：“一旦你认可了使用细胞疗法来治疗患者，那么生产一个同时包括CAR和TCR的产品的成本并不会增加多少。”

去年9月，葛兰素史克（GlaxoSmithKline，GSK）公司斥资6100万美元从Adaptimmune公司买入了一个TCR基因疗法项目。这个信号表明大量涌入CARs的投资也惠及TCRs。不过在TCRs领域的一个明确的临床成功将对这一领域的投入产生很大帮助。“现在很多公司都在等待看到概念验证上的成功才会跟进，”Greenberg博士说。不过那些在TCR领域孤独地工作了数十年的核心科学家们终于很高兴地看到，这项技术成为治疗癌症的主流之一并且在经历爆炸性的发展。

来源：药明康德