抗体偶联药物（ADC）研究报告

ADC药物概述

化疗一度是癌症的标准疗法，但高杀伤力的小分子药物会误杀正常细胞，引起严重的副作用。抗体药物则以其靶向性带来更好的安全性。ADC则融合了抗体的靶向作用和小分子药物的细胞毒性，成为一种“生物导弹”。

ADC的概念由来已久，早在1913年，Paul Ehrlich就提出通过单克隆抗体“haptophore”来靶向癌细胞输送细胞毒性药物“toxophore”来治疗癌症。

抗体-药物偶联剂（Antibody-drug conjugates, ADC），一种将化合物类药物通过连接物（linker）与抗体偶联形成的药物，既有抗体的高靶向性又有化学药物的强杀杀伤力，成为肿瘤治疗用单抗的研究与发展热点。

ADCs经过血液运输到达并识别有表面抗原的癌细胞，ADCs的抗体部分与抗原结合以后被内吞进入癌细胞内部并进一步在溶酶体中被剪切，释放有杀伤作用（作用于DNA或细胞微管）的化合物类药物。吸收ADC药物的细胞死亡裂解后，毒素分子会释放至附近的其他肿瘤细胞进一步发挥杀伤作用。

ADC药物作用机制

ADCs药物的研发包括：药物靶点的筛选，重组抗体的改造与制备、linker的技术开发和高细胞毒性化合物的优化等。

ADCs药物的抗体部分：其靶点多为肿瘤细胞特异性表达，或过表达的表面抗原，如Her 2（Perrino et al., 2014）；新生血管的maker，如ED-B；肿瘤干细胞（TIC）的诱导分子，如EGFR。最常用的是人源IgG1。

部分ADC药物识别靶点（Diamantis & Banerji, 2016）

ADCs药物的化药部分：主要是对癌细胞具备更强的杀伤效力的化合物，1，作用于微管蛋白，如MMAD；2，破换DNA结构，如calicheamicin、duocarmycin（DM）等。如： SeattleGenetics公司在研的ADCs药物多使用微管蛋白聚合酶抑制剂MMAE、MMAF等； Immunogen公司在研的ADCs药物多使用微管蛋白解聚剂美登素DM1、DM4等。近年国际众多制药巨头对于ADCs药物的开发热情持续高涨，辉瑞、雅培从Seattle Genetics公司，礼来、诺华从ImmunoGen公司，默克从Ambrx公司分别引进ADCs药物开发技术。

ADCs药物的连接物：笔者认为ADC药物研发的关键在于连接物的选择，在ADCs药物进入靶细胞前，它能确保偶联药物的完整性；进入作用靶点，连接物又要确保化学药物的有效释放。早期失败的Mylotarg的最大问题在于连接物在血液运输中被过早的破坏，化合物药物提前释放。

ADC药物偶联与linker的发展

早期的ADC药物的瓶颈受到了连接物的限制，随着相应研发力度的加大，ADCs也进入快速发展阶段。下图为已经上市的3个ADC药物的抗体连接位、linker（连接物）以及化药的结构：

Mylotar（Calicheamicins）；Adcetris（Autistatins）； Kadcyla （maytansinoids） （Tsuchikama & An, 2016）

化合物药物跟抗体的比例（DAR）一般为2“～4:1。如果链接物疏水性较强，DAR超过5就可能导致ADCs聚集沉淀，因此，链接物适当的亲水性可以稳定抗体、连接物和化合物分子的结合。下面先介绍抗体与连接物的偶联方法，及其相对应的抗体改造方法：

赖氨酸偶联：赖氨酸是抗体中最常见的连接位，其氨基可以连接物的羧基反应，形成生物体中最可靠的酰胺键。一般抗体含有80个赖氨酸，其中10个赖氨酸基团可用于化学修饰，并且在某些抗体中的赖氨酸有被改造替换。如，美登素（maytasinoid）结合的ADCs药物的抗体/化药比例大概为1：3.5-4，代表药物为Kadcyla。

半胱氨酸偶联：一般情况下，抗体表面没有自由的硫基，都是以二硫键的形式存在。在最常用的IgG1中有4个蛋白链之间的二硫键和12个蛋白链内部的二硫键，而打断前者的4个二硫键对抗体的结构与功能没有太大影响，且可以提供自由的硫基作为偶联位点。目前有两种方法：

在不改变抗体功能的前提下，对mAbs的重链或者轻链进行修饰改造（Chudasama, Maruani, & Caddick, 2016）：在抗体编码序列中插入Cys（半胱氨酸）：比如2008年Junutula提出用点突变的方法在mAbs上加入Cys（Junutula et al., 2008），之后科研人员在识别卵巢癌细胞表面抗原MUC16的抗体插入两个Cys位点，改造的抗体称为THIOMAB，用CuSO4保护抗体本身的二硫键，使插入的Cys与细胞骨架抑制剂MMAE结合形成二硫键，其药物抗体比约为2。

用还原剂打断抗体两个蛋白链之间已有的二硫键，直接与芳钯复合物的两个硫基（其药物抗体比约为4），或者与以芳基半胱氨酸的硫基结合（其药物抗体比约为3.5-4.4）

非天然氨基酸介导定点偶联：除了利用抗体中常见的Lys和Cys外，一些人工改造的氨基酸也被加入抗体用作结合位点，如：A,Schultz利用特殊的t-RNA携带乙酰化苯丙氨酸（p-acetylphenyalanine），在抗体中插入乙酰化苯丙氨酸，可以与MMAD形成肟连接，药物抗体比率为2:0（Axup et al., 2012）。B，VanBrunt利用对 - 叠氮基甲基-L-苯基丙氨酸（p-azidomethyl-L-phenylalanine）在铜的催化下与带有炔的连接物结合。C，带有八碳结构的环辛炔的连接物可在没有铜催化的情况下与叠氮结合（Tsuchikama & An, 2016）。

以上的赖氨酸、半胱氨酸及非天然氨基酸介导定点偶联归为化学键偶联。为了更精准的控制抗体/化药比例，可以识别抗体表面特定氨基酸序列的酶催化定点偶联被提出。

酶切介导的定点偶联：

如下图A：如金黄色葡萄球菌中的Sortase A可以识别LPXTG序列，并切断TG之间的肽键，插入还有重复甘氨酸序列的分子。Beerli在抗体的重链和轻链的C末端拆入了LPET序列，与带有甘氨酸链的MMAE偶联，抗体/化药比为1：3.2。

如下图B：链霉菌mobaraense 中分离出的特异性的识别LLQG序列中的谷氨酰胺谷氨酰胺转移酶（TGs）（Sunbul & Yin, 2009）。如抗体的295位谷氨酰胺作为结合位点可以得到抗体/化药比为1：2的ADCs药物；又如甲酰甘氨酸酶（FGE）可以将CXPXR 序列中的半胱氨酸的残基替换成醛基，之后利用HIPS反应连接化合物。

如下图C：基本所有的抗体都有Asn297, Zhou利用β-1,4-半乳糖转移酶（GALT），α-2,6-唾液酸转移酶，NaIO4在N297的糖基末端加入醛基，但抗体/化药比较低为1：1.6。

如下图D：先利用内切糖苷酶S2对Asn297的糖基进行剪切后与上带有叠氮的乙酰结合，之后叠氮与环辛炔形成稳定的ADCs药物，抗体/化药比非常稳定，为1:2。

对各种不同定点偶联位点的方式进行比较：

连接物根据其解离特性，可分为”可降解类“和”非降解类“：

可裂解linker：

如下图A：腙连接物（Hydrazone linker）：Mylotarg使用一个双功能的链接，4-（４？乙酰苯氧基）丁酸，一方面通过一个酰胺键和抗CD33抗体表面的赖氨酸结合起来，另一方面和修饰上酰肼的Calicheamicin形成腙。腙在血液中pH=7.3-7.5相对稳定，进入细胞里的溶酶体（pH=4.5）后水解。

如下图B：蛋白酶B连接物 （Cathepsin B-responselinke）：CathepinB在肿瘤细胞中过表达，且可特识别一些二肽，如Phe-Lys和Vat-Cit。 Seattlegenetics的Adcetirs利用含有顺丁烯二酰亚胺的二肽将MMAE和单抗的半胱氨酸残基连接起来。二肽链接在血浆里具有很高的稳定性并且提供了一个蛋白酶水解的位点，MMAE以完整的活性形式释放出来。

如下图C：谷胱甘肽敏感连接物（glutathione linker）的断裂依靠细胞内的高浓度谷胱甘肽（1-10mmol/L），当进入细胞后，细胞高浓度的内谷胱甘肽还原裂解二硫键并释放有化药分子。

如下图D：焦磷酸二脂连接物（pyrophosphatediester linker）：Garbaccio开发了一种新型焦磷酸二酯结构的连接物，此负电荷的连接物有较好的亲水性和稳定性。进入细胞被溶酶体剪切后，连接物和药物共同释放，之后二酯经历两步骤酶促接头裂解，释放有效载有单磷酸分子的化合物药物。

此外还有β-葡萄糖醛酸连接物：如CD30的抗体通过β-葡萄糖醛酸连接物于MGBs相连，β-葡萄糖醛酸的剪切会导致苯环对位的电子转移从而断裂释放化合物类药物。

不可裂解的linker：相比于剪切连接物有更好的稳定性，在整个药物作用过程中，始终保持抗体与化学药物的偶连完整性，在进入溶酶体以后mAb被剪切降解，化合物药物得到释放。Kadcyla使用的便是此类非降解连接物，所以，该药进入靶细胞后最终会降解为氨基酸、抗体、化学药物等组分的混合物。

ADC药物市场表现

1970-1990，ADCs药物经过动物实验并进行临床测试，直至2000年，FDA批准了首例ADC药物的临床实验：Mylotarg，一种连有calicheamicin（烯二炔类）的CD22抗体药物的，但之后发现在治疗急性骨髓白血病的效果并没有超过传统的化药且有患者患肝小静脉闭塞的几率提高，2010年辉瑞公司宣布放弃。2011年，FDA批准Adcetris （seattle genetics），用于霍奇金淋巴瘤治疗，由识别CD30的IgG1和微管蛋白抑制剂MMAE偶联而成，每个单抗可以连接4个MMAE。上市第一年销售额达1.36亿美元。2013年，Kadcyla（罗氏）进入市场，用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌患者，由识别her2的曲妥单抗和细胞毒素DM1偶联而成，平均连接数为3.5。

ADC药物整体上仍然呈现研发热而市场表现平平的形势，Kadcyla今年前三季度销售额6亿美元，增长已呈乏力。

国内ADC药物研发格局

国内布局ADC药物研发的药企有博生吉、荣昌、张江生物、美雅珂生物、浙江医药、百奥泰、恒瑞医药、多禧生物/华海药业、昭华生物等。

烟台荣昌：荣昌生物由荣昌制药与房健民教授合作发起成立，是国内较早布局ADC药物的企业之一。荣昌生物旗下拥有RC48、RC58、RC68等ADC药物，涵盖淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺小细胞癌等多个适应症。其中RC48（Her2抗体-MMAE）是国内首个进入临床研究的ADC药物。

浙江医药：浙江医药布局ADC药物是通过与Ambrx合作，引入后者的ADC药物ARX788在中国区的权利。Ambrx的定点偶联技术通过引入非天然氨基酸实现，技术源自Scripps研究所首席执行官、大名鼎鼎的Peter G Schultz教授。Ambrx的现任高管CEO乔铁成、CSO Feng Tian博士、CMO 黑永疆博士均为华人，Ambrx的投资方也包括复星、人福、厚朴基金、光大控股等众多中国背景的投资人。此外，海正药业也与Ambrx合作开发双特异性抗体药物。更多信息参见前文：安博生物Ambrx定点偶联ADC药物技术平台。

张江生物：张江生物的ADC产品为跟踪型技术，一方面开发了Kadcyla的类似药，另一方面又跟踪开发Probody Drug Conjugate药物，该技术的开创企业为Cytomx。更多信息可以参见前文：国内首个ADC类似药：张江生物的Kadcyla类似药相似性分析。以及Cytomx开创Probody技术平台，张江生物fast-follow进行二次创新。

美雅珂生物：美雅珂生物的ADC药物MRG003于今年8月递交IND申请，应该是前期兄弟公司津曼特生物的EGFR单抗加上小分子药物CPT-11，算是国内几个HER2类ADC药物中的清流。

百奥泰：百奥泰开发了称为Betansine的ADC专利技术平台，旨在提高linker的稳定性，旗下HER2-美登素抗体偶联药物已于2016年9月获批临床。

恒瑞医药：恒瑞旗下SHR-A1201目前处于临床申请在审状态，应为Kadcyla的类似药，按2类申报，2016年9月获批临床。此外，恒瑞还开发了新毒素SHR153024，恒瑞称其具有更广的安全窗口，比MMAF高64倍。应用该技术平台的至少有3个新的ADC在研药物。

昭华生物：昭华生物的ADC技术平台从美国Concortis Biotherapeutics买入，后者是华裔企业家黄馨祥所创办Sorrento的子公司，专注ADC药物的开发。Sorrento与国内企业的合作非常广泛：与张江生物合作推进其生物类似药在欧美市场的临床开发，与三生制药合作开发CAR-T细胞疗法。

Concortis Biotherapeutics的研发管线

多禧生物：多禧生物海归研发团队有三位参与过Kadcyla的开发，在多禧优化开发了新的专利ADC技术平台，并在2016年10月与华海药业旗下华奥泰及华博签订合作协议，将其ADC技术平台应用到后者开发的药用单克隆抗体上。未来可期待多禧生物开展更广泛的合作。

Medchemexpress（MCE）则可提供多种ADCs cytotoxin和Linker。

国外在研ADC药物

ADC药物研发热度依然高涨，处于临床阶段的即有至少60余个。

小编总结

ADC药物本身是很好的concept，但其技术转化上仍期待更大突破。抗体作为导弹的靶向性和小分子作为毒性分子的弹头，两个关键点已经齐备，但抗体需要有效内化、linker需要高效的释放同时在胞外保持稳定性，这其中仍有诸多难点，导致小分子进入靶细胞内并起效的比例微乎其微，带来很大有效性与安全性的潜在问题。

文中重点介绍了linker的发展，实际上ADC药物的复杂性带来的挑战远不止此。偶联小分子后的ADC往往稳定性大大降低，制剂开发更为复杂，目前上市的ADC药物只有冻干粉针，还没有液体制剂。纯化工艺方面，linker的残留要严格控制，游离的linker也是一个很大的安全隐患。因为生产工艺的复杂性及更高的安全标准，往往也限制了CMO的选择，ADC药物研发企业也应注意。

总之，ADC药物的前景尚不明朗，期待更多的技术突破。

最后感谢团队成员给予的帮助，特别感谢@Alpharesearcher。

参考资料

Synthesisof site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids（2012）；

Antibody-drugconjugates: basic concepts, examples and future perspectives（2012）；

Antibody-drugconjugates--an emerging class of cancer treatment（2016）；

Antibody drug conjugates lessons from 20 years of clinical experience（2016）；

Antibody-drug conjugates recent advances in conjugation and linker chemistries（2016）；

Coming-of-age of antibodies in cancer therapeutics（2016）；

Recent advances in the construction of antibody-drug conjugates（2016）。

Ehrlich, P.Address in pathology, ON CHEMIOTHERAPY: Delivered before the seventeenth international congress of medicine. Brit. Med. J.2, 353–359 （1913）。

Mullard, A. （2013）。 Maturing antibody-drugconjugate pipeline hits 30. Nat Rev Drug Discov, 12（5）， 329-332.doi:10.1038/nrd4009

Sievers, E. L.,Larson, R. A., Stadtmauer, E. A., Estey, E., Lowenberg, B., Dombret, H., . . .Mylotarg Study, G. （2001）。 Efficacy and safety of gemtuzumab ozogamicin inpatients with CD33-positive acute myeloid leukemia in first relapse. J ClinOncol, 19（13）， 3244-3254. doi:10.1200/jco.2001.19.13.3244

Tsuchikama, K.,& An, Z. （2016）。 Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries. Protein Cell. doi:10.1007/s13238-016-0323-0

文/ MT 生物制药小编（微信号 Biopharm2016）授权文章，转载请联系原出处

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