史上最快！加州大学开发新型CRISPR递送系统，仅需一周，即可造出抗癌T细胞

Yescarta和Kymriah的接连批准，让基于修饰免疫细胞的新型治疗手段正式走入临床。不过两款药物商业化不久，却也出现了些许“供不应求”的尴尬。

CAR-T细胞的生产跟不上患者的需求，其中不可忽视的就是，艰难而漫长的病毒转染介导的基因编辑过程。

近期，《自然》杂志发表了加州大学旧金山分校研究者的最新研究成果，他们开发出了一种基于电穿孔技术的CRISPR/Cas9递送系统，无需病毒转染，更加快速、安全，成本也更低。利用这种技术，研究者成功修复了单基因突变患者的缺陷细胞，也成功向T细胞中转入大于1kb的DNA序列、制造出对黑色素瘤细胞靶向性更强的TCR-T细胞，并且在体内表现出更好的抗癌效果。[1]

如果使用这种新技术，对T细胞的基因修饰可以在一周左右完成，比一般的基因编辑方法要快得多！

在重新编辑T细胞这个方向上，科学家们已经花费了几十年的时光，目前使用得最广泛、效率最高的技术手段就是利用病毒搭载基因编辑工具。不过呢，病毒载体也有它的缺点，比如寻找合适的病毒载体并不容易，可能需要很长时间来匹配，这期间也会消耗很多经济成本；而且虽然风险不大，病毒载体本身还有破坏正常基因序列的可能的[2,3]。

那么有没有更好的递送方式呢？

电穿孔这项技术，奇点糕记得自己是第一次在高中生物书上看到的，电穿孔促进体细胞融合嘛。理论上来说，施加适当的电场能够增加细胞膜的通透性，让Cas9酶、DNA片段和其他需要的原件进入细胞，这样就可以不用病毒把基因编辑“剪刀”送进细胞了！

可是说起来容易做起来很难。本篇论文的第一作者Theodore Roth博士在摸索条件上花费了整整一年时间。Cas9蛋白和DNA的比例、培养细胞的方式、细胞的数量、电场的模式和强度，Roth博士尝试了数千个条件，终于找到了能够导入长DNA序列同时，又让细胞保持健康活力的条件。

研究者尝试利用这种方法，向T细胞中转入标记了绿色荧光蛋白的“管家基因”RAB11A，结果显示50%的细胞都出现了绿色荧光，可见这些细胞都被成功编辑了！研究者还尝试了其他几种靶向基因，也都成功了。

这种技术还有个优势，就是它“不挑剔”，新鲜提取的T细胞也可以，冷冻保存的T细胞也可以，还有一些其他临床上可能遇到的T细胞形态，都是可以正常应用的。

实验流程

那么这种技术应用到现实的临床治疗场景会如何呢？

研究者首先找到了一个家系的三个后代，他们都患有因IL2RA基因功能缺失突变导致的自身免疫疾病[4]。IL2RA是白介素2受体的关键组成部分，也是部分T细胞正常发育的关键[5]。

从这三位患者体内取出的细胞呈现两种不同的突变，一种是单碱基突变，一种是移码突变。对前者，需要“剪去”错误序列插入正确序列；对后者，替换正确序列可以，直接剪掉错误序列也可以。

对这两种突变，电穿孔CRISPR编辑都成功地“修正”了细胞的缺陷，施加IL-2刺激后表现得与正常细胞一样！

修饰后对IL-2刺激的反应恢复正常

当然，修复基因突变并不是唯一的用处，文章开头提到的CAR-T细胞也是利用基因编辑技术修饰T细胞，实现更好的抗癌效果。研究者想，也可以给T细胞“加点料”，让它们能够更好地识别癌细胞。

于是研究者往来自健康志愿者的T细胞中，转入了一套特异性识别黑色素瘤细胞的TCR序列（1G4）[6]。当研究者把修饰好的T细胞和两种黑色素瘤细胞共培养，T细胞立刻特异性产生了大量的IFN、TNF等细胞因子。

而且，电穿孔介导的基因编辑，与病毒转染介导的基因编辑效果相对一致，编辑后细胞产生的细胞因子水平也差不多，在体外对癌细胞的杀伤能力也都一样强！

多种细胞因子水平相似

对癌细胞的体外杀伤能力与病毒转染的T细胞无差别

最后，研究者还尝试在小鼠体内模拟了整个细胞治疗过程。取健康人的T细胞、体外扩增、修饰、再输入患癌小鼠体内。

这批修饰过的T细胞明显更集中在患处、更持久、也表现出更强的增殖能力。从肿瘤增长速度来看，得到经过电穿孔CRISPR修饰的T细胞治疗的小鼠肿瘤增长更慢，差不多只有对照组小鼠的一半，此外也比慢病毒转染的T细胞抗癌能力更强！

电穿孔CRISPR修饰的T细胞抗癌能力更强

电穿孔CRISPR技术的整个修饰流程只需要大约一个星期，这期间完成gRNA和DNA序列的设计和合成，并完成整个修饰过程。

旧金山Park癌症免疫研究所的副所长Fred Ramsdell说，“以前完成免疫细胞修饰可能需要几个月甚至一年，现在或许只要两个星期。如果你是患者，你就会知道，几周和几个月有本质上的差别。”[7]

除此之外，不使用病毒转染，一方面降低风险，另一方面还能降低成本。

这项技术已经在Marson教授自己的实验室中得到了广泛的应用，一些以前由于病毒载体导致的很困难、或者很昂贵的实验思路，现在已经变得触手可及。而整个流程的快速方便，使实验进展加速到原来的好几倍。

研究者们还认为，这种技术可以用在更加广泛的领域，比如识别感染、抑制自身免疫疾病中出现的过度免疫反应，甚至治疗HIV感染。[8]

可以期待研究者继续寻找将更长DNA序列转入细胞的方法，那时，制作CAR-T细胞也将不再像今天这么困难了！！

参考资料：

[1] https://www.nature.com/articles/s41586-018-0326-5

[2] Rosenberg, S. A. & Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science 348, 62–68 （2015）。

[3]Verhoeyen, E., Costa, C. & Cosset, F.-L. Lentiviral vector gene transfer into human T cells. Methods Mol. Biol. 506, 97–114 （2009）。

[3] Sharfe, N., Dadi, H. K., Shahar, M. & Roifman, C. M. Human immune disorder arising from mutation of the alpha chain of the interleukin-2 receptor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 3168–3171 （1997）。

[5] Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M. & Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains （CD25）。 Breakdown of a single mechanism of self-tolerance

causes various autoimmune diseases. J. Immunol. 155, 1151–1164 （1995）。

[6] Robbins, P. F. et al. Single and dual amino acid substitutions in TCR CDRs can enhance antigen-specifc T cell functions. J. Immunol. 180, 6116–6131 （2008）。

[7]https://www.nytimes.com/2018/07/11/health/gene-editing-cancer.html

[8]https://www.ucsf.edu/news/2018/07/411071/t-cell-engineering-breakthrough-sidesteps-need-viruses-gene-editing

来源：奇点网

作者：奇点糕

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